大家好,今天和大家分享的是19年发表在The Journal of Clinical Investigation杂志上的一篇关于肿瘤免疫微环境的文献。标题的大致含义是“局部免疫环境能够决定肿瘤PD-L1的异质性,进而影响肿瘤对免疫治疗的敏感性”。
在背景部分,作者指出:
PD-L1在难治性肿瘤的治疗方面是一个很有潜力的靶点。然而,PD-L1+肿瘤的免疫环境及肿瘤的特点,以及它们影响治疗效果的机制目前还不清楚。
在本项研究中,作者通过对32种肿瘤类型的9769名患者的基因数据进行分析,发现患者局部免疫情况可以决定PD-L1的异质性与肿瘤生物特征,并进一步影响患者临床结局。
接下来,是文章的结果总览,文章大致可以分为表型、机制和药物治疗三部分:图1和图2对应表型部分,图1说明PD-1与多种肿瘤的免疫特征相关,图2 说明高表达PD-L1的肿瘤免疫环境决定了患者的临床结局;图3、4、5、6对应文章第二部分,阐述了肿瘤巨噬细胞和T细胞分别通过不同的途径,诱导癌细胞PD-L1;图7、8则对应文章的第三部分,图7说明两种不同方式诱导产生的PD-L1 +肿瘤细胞对免疫治疗的反应不同,图8说明免疫检查点阻滞治疗联合NF-κB通路抑制能有效地抑制肿瘤生长。
接下来,是文章的数据部分:
图A是对345名肝癌患者的PD-L1和IFN-γ相关性进行分析的结果。其中蓝色代表PD-L1,红色代表IFN-γ。以IFN-γ为例,可以看到随着IFN-γ表达的升高,PD-L1表达并没有随之升高,反之亦然,从而说明高表达IFN-γ的组织并不伴随PD-L1的高表达。
图B是对TCGA数据库32种肿瘤的9138名患者的RNA-seq数据进行分析,其中27种类型IFN-γ与PD-L1没有相关性或为弱相关。
图C是将32种癌症样本中的9138例患者按每种肿瘤内PD-L1或IFN-γ表达的平均值分为两组。发现只有极少部分的高表达PD-L1的样本同时呈现IFN-γ高表达的特征
图D是对来自TCGA数据集的肝癌样本中进行分析,发现肝癌组织中有53种基因与PD-L1表达相关,进行GO分析发现4条富集程度较高的通路与肿瘤坏死因子或白介素-1特征相关(图1D)
图E是基因富集分析的结果,进一步证实了与IL-1和TNF特征相关的基因主要富集在PD-L1高表达的肝癌组织中
图A是未经过处理、T细胞的培养基(T-cell-CM)处理、巨噬细胞的培养基处理后HepG2细胞蛋白表达情况
从中可以看到T-cell-CM能激活肝癌细胞表达STAT1;TAM-CM能强烈激活肝癌细胞表达STAT3。
图B是加入抑制剂后的回复实验结果,说明加入NF-κB通路抑制剂后巨噬细胞诱导PD-L1表达 下降,而阻断STAT1信号通路T细胞诱导的PD-L1表达下降
图H和I是注射抗T细胞标记物CD3抗体和抗集落刺激因子1抗体后,肿瘤细胞PD-L1表达情况
这一部分说明肿瘤免疫微环境中,巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-1β被肿瘤细胞表面相应受体识别,引起NF-κB通路激活,诱导PD-L1表达;T细胞分泌干扰素γ,与肿瘤细胞表面受体结合引起信号通路激活,诱导PD-L1表达。
图A、B、C是对比了两种来源的PD-L1阳性肿瘤细胞的凋亡、细胞迁移表型:图A是在血清饥饿条件下肿瘤细胞中凋亡相关的蛋白的表达不同,图B是凋亡细胞数目,说明T-cell-CM培养过的HepG2细胞在血清饥饿条件下更易凋亡;图C对比肿瘤细胞迁移能力,说明TAM-CM处理过的HepG2细胞更易发生迁移;
图D和图E对比了肿瘤细胞上皮细胞-间充质转化能力,说明巨噬细胞诱导的PD-L1 +肝癌细胞选择性表达波形蛋白,E-钙黏蛋白减少,更容易发生提示上皮-间质转化(EMT)
接下来作者在TCGA数据集结肠癌、胃癌、肺腺癌样本中进行重复验证,CD68/CD3E高比例样本中与血管生成特征、转移特征和EMT样特征的基因集富集,说明在高表达PD-L1的HCC、COAD、LUAD和STAD肿瘤中,EMT、转移和血管生成的基因选择性富集
图A是细胞迁移实验,通过添加通路阻断剂和rna干扰下调P65表达后,观察肝癌细胞迁移能力,其中siNC组作为rna干扰的阴性对照组,DMSO作为药物溶剂,设置该组作为对照
图B是经过图A处理后,观察与上皮-间充质转化相关的基因转录水平改变
图A、B说明通过抑制NF-κB通路或抑制P65表达后肝癌细胞的迁移下降和上皮-间质转化表型受到抑制
图C是癌细胞接触肿瘤坏死因子α和白介素1β后观察STAT1通路和NF-κB通路蛋白磷酸化改变,可以观察到癌细胞接触坏死因子α和白介素1β后,p65发生磷酸化;接触干扰素γ后,stat1发生磷酸化
图D是免疫荧光实验,可以观察到癌细胞接触肿瘤坏死因子α和白介素1β后细胞核内出现P65代表的红色,说明发生P65入核,进一步说明NF-κB通路被激活
图C和D说明癌细胞接触TNF-α和IL-1β后,激活NF-κB通路,导致肝癌细胞的迁移和上皮-间质转化能力增强
图E、F、G与图A、B设置类似,说明的是癌细胞接触TNF-α和IL-1β后,迁移增强和上皮-间质转化能力增强
图A对比肿瘤细胞对阿霉素反应,可以看到同等药物浓度下,巨噬细胞诱导的PD-L1阳性肿瘤细胞凋亡程度最低,而图B、C中通过抑制NF-κB通路或调低P65 NF-κB亚基表达则能提高凋亡细胞的比例
图E对比肿瘤细胞对T细胞杀伤作用的抵抗能力,我们用直接从小鼠Hepa1-6肝癌中分离的CD8 + T细胞培养这些细胞。未经过巨噬细胞诱导处理的肿瘤细胞与CD8 + T细胞接触3至6小时后,被杀灭。转染PD-L1的Hepa1-6细胞可以部分抵抗T细胞的细胞毒性,但这个过程通过抗PD-L1抗体而被阻断。巨噬细胞诱导产生的PD-L1 +肝癌细胞能抵抗 T细胞的细胞毒性
图A和B探究的是巨噬细胞产生的PD-L1+肿瘤细胞对免疫治疗产生的影响,将 PD-L1阳性鼠源性肝癌细胞接种到老鼠肝脏,使用抗PD-L1抗体,抗巨噬细胞标记物抗体处理,分析肿瘤大小,结果发现抗PD-L1抗体联合巨噬细胞清除能有效抑制肿瘤组织的增殖(图10A和10B)。
图C和图D与A、B设计类似,说明抗PD-L1抗体联合抑制P65表达,能起到同样的抑制效果。
补充材料中,黑色素瘤接种小鼠背组织后经过抗CSF1R ,αPD-L1 或αCSF1R Ab +αPD-L1 Ab处理后,观察肿瘤体积大小,图B是经过处理后肿瘤大小,可以看到免疫检查点阻滞治疗联合体内巨噬细胞清除能有效地抑制肿瘤生长
由巨噬细胞促炎反应导致NF-κB信号通路激活产生的PD-L1+肿瘤细胞表现出侵袭性生存、促血管生成、转移等特点
由激活T细胞所产生的STAT1信号则会导致PD-L1+肿瘤细胞的凋亡。
由此导致的重要结果是,由巨噬细胞所建立的PD-L1+肿瘤细胞对传统化疗、肿瘤特异的效应T细胞的细胞毒性作用、免疫检查点阻滞疗法效果不佳。
而免疫检查点阻滞治疗联合体内巨噬细胞清除(或NF-κB通路抑制)能有效地抑制肿瘤。
本研究揭示了PD-L1+肿瘤的功能特点,并提示对炎症细胞的功能活动施加影响能提高肿瘤检查点阻滞疗法的疗效。
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