文献精读 LincRNA 1281的m6A修饰对小鼠胚胎干细胞的分化潜能至关重要

by 菜泡饭

原文链接：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5934679/

知识点积累

1. m6A作为mRNA的普遍的修饰，在含有METTL3的甲基转移酶时mRNA前体转录后立即发生m6A甲基化;而FTO和ALKBH5负责m6A去甲基化。 通过甲基转移酶和去甲基化酶之间的相互作用，m6A水平保持平衡，形成m6A结合蛋白的对接位点和RNA二级结构的适当组装。具有足够的m6A水平的mRNA转录物可被适当剪接，转运，翻译或降解。随着m6A测序技术的发展和成熟，目前发现在非编码RNA如lincRNA，miRNA，circRNA等中均存在m6A修饰，然而在非编码RNA中m6A修饰的功能尚未被完全探索，给予研究者广大的研究空间。

2. LincRNA：位于编码蛋白的基因之间，其中长度超过200nt的非编码RNA。目前对其的功能研究主要为以下几个方面1、转录干扰；2、诱导染色质重构和核小体修饰；3、调控可变剪接模式；4、产生内源siRNAs；5、调控蛋白质的活性；6、结构或组织功能；7、改变蛋白质的定位；8、小RNA的前体等。

3. ce RNA：competing endogenous RNAs,内源竞争RNA。已知microRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA可以通过竞争性地结合microRNA来调节基因表达。ceRNA可以通过应答元件（microRNAresponse elements，MREs)与microRNA结合从而影响microRNA导致的基因上调，这揭示了一条RNA->microRNA调节通路的存在，具有重大生物意义。

实验结果

1.lincRNA 1281对小鼠胚胎干细胞的分化潜能至关重要

为了研究lincRNA 1281在鼠源性胚胎干细胞中的功能，首先作者用RT-PCR技术发现抑制小鼠胚胎干细胞分化可明显下调lincRNA1281的表达。又用RNA FISH实验明确了lincRNA1281在细胞中的定位（胞质），为后续研究lincRNA 1281的功能在提供位置上的引导。那么敲低lincRNA1281对胚胎干细胞到底有怎样的影响呢？作者用shlincRNA1281的细胞做了一系列表型实验。发现敲除lincRNA 1281对胚胎干细胞的再生能力并没有影响，主要体现在一些再生能力指标没有什么变化。而敲除lincRNA1281后，胚胎干细胞的分化能力显著下降，主要表现在体内实验的畸胎瘤体积和重量减小，畸胎瘤的一些列分化指标的下降。以上提示linc RNA1281对小鼠胚胎干细胞的分化潜能至关重要，且为促进作用。

2.linc RNA 1281存在m6A修饰且与lincRNA 1281在鼠胚胎干细胞中的作用正相关

以往文献提示在胚胎干细胞分化过程中，m6A发挥相当重要的作用，且非编码的lincRNA的m6A修饰也已有报道。作者想要了解在鼠源胚胎干细胞中，lincRNA是否存在m6A修饰以及发生m6A修饰的linc RNA 1281发挥着怎么样的作用。首先作者通过MeRIP实验证明linc RNA1281存在m6A修饰，且敲低mettl3后lincRNA 1281本身表达并未受到影响而lincRNA 1281上的m6A修饰显著下降。那么lincRNA 1281的m6A修饰位点具体在哪里呢？根据linc RNA1281的m6A修饰预测结构，作者做了一些列的突变实验，发现A916,1024 and 1054-G这三个都是m6A的修饰位点。那么m6A修饰对lincRNA 1281在鼠胚胎干细胞中的作用又有什么样的影响呢？于是作者做了一些列常规敲除和rescure实验，发现A-G突变的lincRNA 1281即不存在m6A修饰的linc RNA 1281无法rescure敲除linc RNA1281对鼠胚胎干细胞分化能力的影响。即linc RNA 1281的m6A修饰可促进鼠胚胎干细胞的分化。

3.Linc RNA1281作为let-7家族的内源性竞争结合RNA（ceRNA）

既然前文已经提到linc RNA 1281在鼠胚胎干细胞中促进其分化，那么它是如何起到促进分化的作用的呢? 根据linc RNA 1281的在胞质中的定位以及目前了解到的其常规功能，作者猜想其是否可作为一个ce RNA来发挥其作用。那么lincRNA1281又是作为谁的ce RNA？目前我们比较常见的模式是lncRNA-miRNA-mRNA，因此作者猜想lincRNA 可能作为与胚胎干细胞分化能力有关的miRNA的ceRNA从而影响miRNA 与目的功能基因的结合。通过文献搜索发现let-7/lin28是与胚胎干细胞分化能力这个表型密切相关的经典miRNA-mRNA轴，于是作者猜想lincRNA 1281可否作为let-7家族的ceRNA。那么要验证这个实验目的，我们常规的实验技术即luciference 双荧光素报告基因实验检测let-7家族的miRNA是否的确能与lincRNA 1281结合。于是构建包含linc 1281全长的报告系统，发现let-7家族的miRNA都能与linc RNA 1281结合，且结合位点分别为425-431以及965-971，这与let-7家族的具体成员有关。既然要证明两者结合，除了用miRNA 去结合lincRNA 检测荧光素活性外，反向即可用linc RNA 和结合蛋白复合体去拉miRNA 结果RIP实验证明的确两者存在相互结合。而且敲除lincRNA1281后，由于与lincRNA结合的miRNA 减少，因此游离出来用RT-PCR可检测的miRNA 增加，对目的基因lin28的抑制作用也增加。

4.Linc RNA 1281的m6A修饰对Linc RNA 1281与 let-7 家族的结合起促进作用

那么m6A在lincRNA1281充当ceRNA中发挥什么作用呢？作者发现当敲除mettl3或者突变lincRNA 1281的m6A修饰位点后，再做luciference实验，发现lincRNA 1281和let-7家族的结合能力下降。经典套路，即敲除和recure。

5.The let7/Lin28 通路可以逆转缺失m6A的lincRNA 1281对鼠源性胚胎干细胞分化能力的影响

为了进一步研究这个ceRNA model是否介导lincRNA1281调节的鼠源性胚胎干细胞分化能力，作者敲除lincRNA 1281后过表达let-7 miRNA的sponge，即与miRNA结合的linc RNA 1281，发现该实验可以有效的逆转lincRNA 1281敲除对分化能力的抑制作用。一系列的表型实验即当过表达let-7 sponge后，敲除lincRNA1281的胚胎干细胞的分化能力增强。当然作者也在补充材料里证明let-7/lin28 轴在胚胎干细胞分化能力中的重要作用。由于先前实验已有报道，故在此论文研究中属于验证性结果放在补充材料中。

总结与思考

本文主要讲了一个lincRNA 1281对胚胎干细胞分化能力起到促进作用的故事。

What：lincRNA 1281对胚胎干细胞分化能力起到促进作用

Why：为什么lincRNA 1281可以促进胚胎干细胞分化能力？作者解释是因为lincRNA 1281发生了m6A修饰

How：发生m6A修饰的lincRNA1281是如何促进胚胎干细胞分化能力？作者又设想了一个ceRNA 的model，并进行了实验证实。m6A修饰促进linc RNA 1281与miRNA let-7家族结合sponge，那么游离态的let-7家族数量就下降，与mRNA lin28（let-7的经典底物）的结合就减少，lin28的转录后抑制减少，蛋白表达增加，而lin28是一个前人实验证实的经典的促进胚胎干细胞分化的因子。

这是我看的第一篇关于ceRNA的文章，而且又与lincRNA 的m6A修饰有关。LincRNA-miRNA-mRNA套路近几年比较火热，在转录后修饰领域研究较为深入，作者又巧妙地将非编码RNA的m6A修饰引入这套系统里，将两者结合的非常好。虽然文章的实验手段都是比较基础，但都很经典很solid地解释了问题，非常扎实。无论是非编码RNA的m6A修饰（结合的RIP实验还是找位点的一些列突变后的RIP实验），还是ceRNA基本的套路（lincRNA-miRNA结合实验）都做得很扎实，rescure实验很完美。两者结合又很有新意，我觉得没有什么缺点，我很喜欢，值得学习。