基因表达检测：rtPCR

生物医学是实验科学，理论免不了运用实验证明。内容也许有些枯燥，但绝对干货满满！

基因表达是指遗传信息从DNA-RNA-蛋白质的传递过程。基因表达检测的就是RNA（中间产物）和蛋白质（最终产物）。

今天分享的是基因表达检测的方法之一：rtPCR

PCR又称为聚合酶链式反应，是成指数倍复制DNA链的过程，而其基本原理是碱基之间互补配对。rtPCR技术是先提取出RNA，然后将RNA反转录为与其互补的cDNA，接下来加好各种待反应物在PCR程序下反应，经过PCR后，再通过跑电泳进行产物检测的过程。

rtPCR的关键步骤：

反转录：将RNA反转录合成cDNA模板

变性：使cDNA双链充分分开，以便引物结合

退火：让引物能结合到模板DNA上

延伸：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下开始合成DNA，使新的DNA链按照模板的碱基顺序延长下去

反转录：反转录是在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程，合成的DNA即为cDNA(complementary DNA)。

在反转录使，根据不同的情况，可选择不同的反转录引物。

Oligo dT：目的RNA有poly A尾巴。对RNA样品的质量要求较高。

Random primer：所有RNA的反转录反应都可。

Specific primer：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

推荐反转录试剂盒：东洋纺TOYOBO ReverTra Ace-α-(FSK-101 100 reactions)

试剂盒使用时反应液配置

配置反转录体系时，先把水和RNA加到PCR管里，65℃预变性5min，立刻冰上冷却1min，然后再加buffer，dNTP，酶，引物，RNase抑制剂。

PCR程序：

注意：

退火的温度一般设置在55℃-60℃之间，或者按引物的Tm值减去5摄氏度。

延伸的时间按照酶的合成速度以及PCR产物的长度来计算。一般taq酶的速度在2kb以内是1kb/min，2kb以上500bp/min。如果按500bp计算，延伸时间就是500/1000*60s=30s。

终止延伸时间的设置，一般设置5min即可。

PCR产物检测：琼脂糖凝胶电泳

注意：

电泳槽里装的电泳液是1X TAE溶液；

琼脂糖凝胶泡在电泳液里，凝胶是带点样孔的，样品就点在这种点样孔里；

电泳槽的一边接电源负极，另一边接电源正极，RNA或DNA带负电，会从负极跑向正极；

电泳时的电压设置为恒压120V；

普通rtPCR的产物长度为300-400bp，使用1.2%的胶；

琼脂糖凝胶配制：将1.2g琼脂糖粉末加入到100ml 1X TAE溶液，微波炉高火2min，停min，再高火min，摇匀，冷却至不烫手，憋一口气迅速往胶液里加5ulEB(EB有毒)，摇匀，倒进制胶盘；

跑胶时随时留意电泳进度，跑好的胶用凝胶成像系统拍照保留。

电泳结果分析

正常条带：条带单一且整齐，大小也符合预期；

非特异扩增：条带大小不对。点样时记得加一孔marker，可以帮助判断条带大小；

涂抹装的条带出现：有可能时镁离子加多了；也可能时电泳液不新鲜，电泳前要注意一下电泳液的状态；

出现引物二聚体：引物设计得不好，或者时PCR条件设置不当，使引物聚集。设计引物时要注意产物的长度，使产物长度与引物二聚体得以区分。

电泳液配方：

使用时要稀释到1X，即取20ml 50X TAE Buffer 稀释到1L。

好啦，今天的分享到这里就结束了，下期再见。