肾癌之自噬基因预后预测模型发5+分

       今天给大家带来的是2020年1月发表在Aging (Albany NY)（IF=5.5）杂志上的文章“Autophagy-related gene P4HB: a novel diagnosis and prognosis marker for kidney renal clear cell carcinoma ”。这篇文章中作者通过5个独立队列一步步筛选出和肾透明细胞癌相关的预后基因P4HB，并通过RT-PCR进行细胞学实验验证，最后分析了P4HB的预后价值。

Autophagy-related gene P4HB: a novel diagnosis and prognosis marker for kidney renal clear cell carcinoma自噬相关基因P4HB：一个肾透明细胞癌的新型诊断和预后标记物

一.研究背景

• 肾细胞癌（RCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占成年人恶性肿瘤的3％。而RCC最常见的病理类型是肾脏肾透明细胞癌（KIRC），其预后不良、病发率高。

• 自噬是一个由多组自噬相关基因调控的多步骤的溶酶体降解过程，可促进营养物质循环，满足细胞代谢需求，与肿瘤生成密切相关。有报道指出自噬可以作为肾细胞癌中EMT的潜在治疗靶点。

二.分析流程

三.结果解析

图1. P4HB的筛选与预后价值（详见分析流程部分）

1.P4HB的筛选

1.1从 TCGA-KIRC 中筛选 ARGs

首先比较KIRC和正常肾脏种222ARGs表达水平，ARGs在KIRC和正常肾脏种差异表达。然后对222个ARGs进行ROC分析，以AUC ≥ 0.9 和p < 0.0001为标准筛选出41个ARGs差异表达基因（表1）。通过NCBI  Pubmed 搜索，发现41个ARGs基因中有31个在KIRC有意义（舍弃），而未被证明的10个基因进一步分析。

表1. TCGA初步筛选出的41个自噬相关基因

1.2通过GEO数据库进行第一次验证

在GEO的独立数据集GSE40435和GSE53757通过GEO2R筛选差异表达的基因，得到1128个基因，和上述10个基因取交集，得到3个基因：CASP4，P4HB和GABARAPL1。

1.3通过Oncomine数据库进行第二次验证

使用Oncomine中的Beroukhim数据集验证CASP4，P4HB和GABARAPL1基因，发现GABARAPL1低表达，而CASP4，P4HB高表达。

标准：KIRC 组/对照组的表达比例＞ 2倍

表S3. Beroukhim数据集验证差异基因

1.4通过HPA数据进行第三次验证

在HPA数据库通过对比59个KIRC和正常肾脏组织切片，分析CASP4、P4HB和GABARAPL1的蛋白表达水平，发现在KIRC组织中P4HB的蛋白质水平明显增加（图2A)，而GA4ARAPL1降低（图2B），而CASP4的蛋白质表达水平在KIRCs和正常组织之间没有显着差异，因此，舍去CASP4。

图2. P4HB和GABARAPL1典型免疫组化图像

1.5通过实验进一步验证

• 图3AB：TCGA数据库中P4HB和GABARAPL1的ROC分析，发现两者的AUC> 0.9且p <0.0001，均可很好区分KIRCs与正常肾脏。

• 图3C：RT-PCR验证P4HB和GABARAPL1在正常肾上皮细胞（H293T）和KIRC细胞（OR-SC-2和Caki-1）的表达水平，发现P4HB的mRNA高表达与数据分析一致，而GABARAPL1的mRNA也高表达与数据分析不一致，因而舍去。

图3. P4HB和GABARAPL1的ROC分析与实验验证

2.P4HB的预后意义

• 图4A：TCGA-KIRC 数据库中以P4HB中位表达将患者分成高表达组和低表达组，并绘制生存曲线，证明低表达组OS较好。

• 图4B ：使用STRING数据库探索P4HB相关的已知蛋白和预测蛋白，发现CALR（得分= 0.999），HSP90B1（得分= 0.998），HSPA5（得分= 0.991），PPIB（得分= 0.986），MTTP（得分= 0.987） ，P4HA3（得分= 0.994），PDIA6（得分= 0.994），PRKCSH（得分= 0.987），CALU（得分= 0.991）和DNAJC3（得分= 0.986）。

图4. P4HB的生存分析与相互作用图

通过卡方检验探究P4HB表达与KIRC患者临床病理参数之间的关系，发现高表达组比低表达组临床分期、复发和死亡比例高。

表2. P4HB与临床特征的联系

单因素和多因素Cox回归分析，临床晚期和高P4HB的mRNA表达导致OS较差，而多因素分析证明了临床分期和P4HB的mRNA表达是独立的预后指标。

表3. P4HB是独立的预后指标

GSEA分析TCGA数据集中P4HB高表达组和低表达组，发现戊糖磷酸途径（图S2.A），果糖和甘露糖代谢（图S2.B），氨基糖和核苷酸糖代谢（图S2.C），半乳糖代谢（图S2.D），IGA生成的肠道免疫网络(图S2.E），蛋白酶体（图S2.F），N-聚糖生物合成（图S2.G）在高表达组中富集。

图S2. P4HB的生物学意义

最后小结一下，作者通过首先5个队列筛选出2个和肾透明细胞癌相关的ARGs，随后，通过 RT-PCR 进行细胞验证，确定只有P4HB在正常细胞和肾透明细胞癌有明显差异。进而，通过单因素和多因素分析确定P4HB可以作为肾透明细胞癌OS的独立预后标记。最后，作者进行了P4HB的生物学意义分析。