大家好，今天小编要和大家分享的是今年5月份发表在Theranostics(IF：8.579)上的一篇文章，“Macrophage correlates with immunophenotype and predicts anti-PD-L1 response of urothelial cancer”，作者通过构建IBCs治疗的LASSO Cox预后回归模型发现了M1的预后价值，将其与常用的指标相比较并通过富集分析得出可能的内在原因，同时也发现了M1与mUC患者的免疫表型相关，让我们花几分钟时间来学习一下这篇文章吧！
Macrophage correlates with immunophenotype and predicts anti-PD-L1 response of urothelial cancer
巨噬细胞与免疫表型相关并预测尿路上皮癌的抗PD-L1反应
免疫检查点阻断疗法(Immune-checkpoint blockades,ICBs)已经日常被用于治疗转移的尿路上皮癌(metastatic urothelial cancer，mUC)，但是ICBs疗法只在一部分mUC患者中起到疗效以及持久作用，因此急需发现稳健的分子标志物。作者基于348例预处理的mUC样本，寻找潜在可能的分子标志物
文章论证M1可以作为uMC患者IBCs治疗效果的标志分子的整体逻辑思路
作者特征选择以及LASSO Cox回归模型构建时的细节：
样本数据来源
本文训练数据来自18年的一篇叫TGF-b attenuates tumor response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells的文章，样本数据为348名接受过PD-L1抑制剂(Atezolizumab)治疗的mUC患者的转录组数据。我们可以从这个网址下载(http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies/)本文的数据，作者已经封装到了"IMvigor210CoreBiologies"包中
本文利用TCGA-BLCA队列对其研究结果进行验证。用TCGAbiolinks包下载了TCGA数据库中TCGA-BLCA转录组数据以及临床信息
所有的RNA-seq数据都被转换为TPM单位后进行特征基因得分的计算
作者从GO、KEGG、REACTOME、HALLMARK获取了所有的功能、通路特征基因集，加上与肿瘤微环境、肿瘤固有通路、代谢相关的特征基因集(从其他文献中收集)以及从CIBERSORT，TIMER，EPIC，xCell，MCP-counter，ESTIMATE中获得的免疫细胞特征基因集，一共7556个特征用于构建LASSO模型
接着针对每个样本进行特征基因分数(signature gene score)的计算，作者采用PCA算法(计算前对特征中的基因进行Z分数标准化)，取PC1作为样本在该特征基因集中的得分
下一步进行特征选择(Feature Engineering)，所有的7556个特征的得分先在全样本范围内标准化后根据以下标准筛选特征
与样本预后相关的，Mantel-Cox检验，p<0.01
与治疗效果有关，指标为CR/PR(完全缓解/部分缓解)，SD/PD(疾病稳定/疾病进展)，p<0.05
经上一步筛选后得到了780个特征在348个样本中构建LASSO Cox回归模型。LASSO模型构建时按六四开把样本分为训练集和验证集，采用10折交叉验证，惩罚项选用lambda.min
之后用得到的各特征的回归系数构建风险得分公式，计算样本的risk score，并用survminer包中的方法(文中出现的cut-pff都由此法算出)确定cut-off把样本分为高/低风险组
大致过程已在论证思路的第二幅图中给出
A-B：左右分别是训练集和验证集中的风险预测模型结果以及样本的特征基因分数，所使用的回归系数以及风险得分的cut-off值都由训练集得到。由最下方热图可以看出M1型巨噬细胞特征基因在低风险组中是高表达的，暗示其可能为IBCs疗效的指标
C-D：分别在训练集和验证集中就高低风险组进行生存分析，高低风险组在预后水平上有显著差异，风险得分与mUC患者预后显著相关
E-F：在训练集和验证集中用ROC曲线检验了风险预测模型的预测能力
G：利用自主抽样法(Bootstrap sampling)获取稳定的预测特征，即每次从训练集中抽取80%的样本，根据上一步得到的780个特征构建LASSO回归模型，重复一万次。统计每个特征出现的频率，以此来选出最稳定的可以预测预后的特征，也就是图中看到的M1型巨噬细胞
H：样本根据M1型巨噬细胞特征基因得分分为高低表达组，生存分析表明该特征有预后价值
上述结果说明了作者构建的风险预测模型的预测能力，并发现低风险组地表达M1型巨噬细胞以及M1特征基因有预后价值，加上自主抽样法的结果，作者认为M1型巨噬细胞有能力预测IBCs的疗效并作为其稳定指标
图2. M1型巨噬细胞有预测IBCs预后能力
现有的预测抗PD-L1治疗效果的组织标志分子一般为TMB(肿瘤突变负荷)、TNB(肿瘤新生抗原负荷)、T细胞浸润情况、PD-L1的表达量等。下面作者将M1型巨噬细胞的预测能力与这几类指标比较，进一步说明M1型巨噬细胞是IBCs的一个稳定的预测指标
A-C：图AB分别是样本M1型巨噬细胞特征值和TMB、TNB的相关性分析，都呈显著的中等相关。图C是M1与IBCs临床疗效的相关性，在完全康复CR的患者中，M1型巨噬细胞特征值要显著高于其他三者
A-C+D：由图D中的AUC可以看出M1型巨噬细胞的预测疗效的能力并不比TMB、TNB好，但是将M1与两者结合则可以提高预测能力。图A-C可以发现M1型巨噬细胞在预测患者预后结果上要比TMB、TNB要表现得稍好些
E：联合M1和TMB可以更好地预测患者预后
F：M1型巨噬细胞的预测疗效的能力要比CD8+T细胞、GEP和PD-L1表达量好
图4.M1与其他指标在疗效和预后预测力上的比较
G-J：在四类不同的接受过免疫治疗的癌症样本中，M1型巨噬细胞特征基因同样可以预测疗效，但并没有好于CD8+T细胞和T细胞基因表达谱(GEP)。四种不同类型癌症样本来源标注在图上方
公共数据库验证队列的信息
接受过PD-L1治疗的mUC患者，转移黑色素瘤样本，接受MAGE-3治疗的非小细胞癌样本，接受多种免疫疗法的晚期黑色素瘤样本，TCGA-SKCM中接受过抗CTLA-4治疗的小鼠，接受过抗PD-1治疗的转移胃癌患者。所有这些样本的转录组数据用于确定M1型巨噬细胞的预后预测能力
K-L：TC和IC分别是IBCs治疗后免疫组化得到的肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1表达等级，PD-L1表达量高者，其M1型巨噬细胞浸润程度也越大
M+S2EF：尽管之前有研究发现mUC患者的分子亚型对其治疗和预后有影响，但在作者的研究中，分子亚型与mUC患者的M1水平仅有微弱相关或两者关系没有统计学意义
S2G：利用多因素COX回归分析发现M1巨噬细胞的浸润水平是一个独立的预后因子
N：作者还发现mUC患者的M1型巨噬细胞浸润水平有识别样本肿瘤中免疫细胞的耗竭情况的可能
图5.不同癌症背景下M1同样有预测能力
A-C：作者基于样本的TME(肿瘤微环境)细胞组成对样本进行一致性聚类(consensus clustering)，得到簇A和簇B。此处TME的细胞组成是根据CIBERSORT算法，用LM22基因特征推断得出。可以看到热图中，簇A样本的M1型巨噬细胞以及另一些细胞的浸润程度大。图C生存曲线看出簇A的预后要显著好于簇B
B：簇A和簇B在一些临床参数上的比较。簇A与BOR(best overall response)、PD-L1表达等级(IC、TC)呈正性关系，与TME中免疫细胞耗竭情况呈负性关系
D：考虑到两簇中免疫表型的差异，作者假设M1型巨噬细胞可能可以推断mUC样本免疫表型。图D中用ROC曲线法验证假设，同时与单核细胞以及CD8+T细胞的能力做比较
E-F：簇A中样本的M1型巨噬细胞细胞浸润程度要比簇B高(E)，在IBCs治疗下有着更好的疗效(F)
这之后作者利用TCGA-BLCA队列做了同样的工作，得到了相似的结果，利用验证集做了检验
下部分内容Figure存在于附表当中，主要研究与M1共同存在的M2型巨噬细胞
较低的M2型巨噬细胞浸润程度预示着更好的预后水平(A)，尽管它与治疗效果(B)以及M1的浸润程度(C)间的关系没有统计学意义，这与之前研究报道的M2促进抑制性TME的形成一致。更进一步，M1与M2的比值与IBCs的疗效有显著正性关系(D)，然而并不能提高预测能力(E)
作者利用DESeq2包在M1高低浸润组间进行差异表达分析，通过条件FDR<0.05得到4538个差异表达基因用于下面的富集分析
A-B：GO和KEGG富集分析一致得出M1浸润程度较高的组中，免疫激活过程显著富集，暗示着更好地免疫治疗应答反应；在M1浸润程度较低的组中，激素代谢过程、药物代谢等通路显著富集，可能与治疗不敏感相关
C：GSEA分析(HALLMARKS和KEGG基因集)结果表明与AB中相似的结果
D：GSVA结果表明M1浸润程度高的样本中免疫激活特征基因高表达；M1低浸润的样本中，内源代谢相关的特征基因活化，尤其涉及激素和药物代谢方面
作者同样在验证集TCGA-BLCA中做了同样的分析，得出相似的结果。综上考虑，M1高浸润的样本伴随着免疫激活，与M1低浸润的样本伴随着药物代谢增强，可能是其对ICBs治疗效果有预测价值的本质原因
图9.M1浸润程度与不同的转录、代谢特征相关
A-C：在TP53、FBXW7发生突变了的样本中，其M1浸润程度要显著高于野生组；而在FGFR3发生了突变的样本中，其M1浸润程度要显著低于野生组，值得注意的是FGFR3突变已被认为是ICBs抵抗的标志分子
D-F：FGFR突变的样本中，免疫表型更多为耗竭型(D)，伴随着低于野生组的免疫评分和较高的肿瘤纯度评分(EF)，且低表达免疫检查点通路，高表达耐药代谢通路(G)
作者同样以TCGA-BLCA队列作为验证集，做相同分析得到了相似的结果，验证了结果的可靠性
小结
今天的文献分享到这里就结束了，让我们快速回顾一下。本文的mUC样本转录组数据来自于已发表的文章作为训练集，以TCGA-BLCA作为外部验证集数据。通过构建LASSO Cox回归模型，发现了MC1有可能作为ICBs的稳定标志物后，将其与如TNB等常见IBCs标志物的预测能力做比较，并通过功能通路富集分析找到了其作为标志物可能的内在原因，从而论证了其作为标志物的价值。在其他方面，作者分析了uMC样本中MC1浸润程度与免疫表型以及自身基因突变的关系。本文论证内容覆盖面广，逻辑思路清晰，值得我们大家学习。我是炒年糕，期待我们下期再会!
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