亲水代谢物组学和代谢流

组织亲水代谢物提取

准备：

提取液：80%（v/v）甲醇，放入-80℃，预冷，2h或者过夜。

1.5毫升EP管提前标记好；

提取：

1)      称取适量的组织，20-50mg，加入500μL预冷好的80%甲醇，干冰上匀浆，保持每个样品的重量，匀浆功率和时间一致。

2)      涡旋30s，置于-80冰箱2h。

3)      离心，4℃，12000rpm，20min。

4)      小心吸取上清到新EP管，真空悬干；沉淀用1M KOH复溶，测定蛋白浓度。

5)      置于干冰上送样。

注意：称重过程尽快，避免小分子降解或者相互转化。拿取EP管的时候，手和管子的接触位置在没有样品的空余位置，避免手温“加热”样品。

细胞代谢流实验

准备

1)      铺细胞，根据对细胞生长速度的了解控制细胞密度，使得在收样的时候，每组细胞数目一致。同时，根据目标代谢物的含量，决定细胞数量（6cm，10cm还是15cm皿）。

2)      待细胞生长正常，（一般12-24小时）更换原来的培养基为同位素标记的培养液，同位素标记的培养液配制参看下表举例。

切记：代谢流实验需要一盘正常培养的细胞做对照。即送样的时候包括：标记的样品和未标记的1份正常样品。

Normal	Glucose tracing	Glutamine tracing
DMEM	DMEM depleted glucose	DMEM depleted glutamine
FBS	Dialyzed FBS	Dialyzed FBS
	Labelled glucose	Labelled glutamine

提取：

1)      加入适量的预冷好的80%甲醇，6cm皿加入500μL，10cm加入1mL，置于-80冰箱2小时。

2)      刮刀刮下细胞，到新的EP管，再用200μL预冷好的80%甲醇润洗培养皿。刮刀每刮完一份样品，用超纯水洗净，擦干，再刮下一个样品。

3)      离心，4℃，12000rpm，20min；沉淀用1M KOH复溶，测定蛋白浓度。

4)      小心吸取上清到新EP管，真空悬干。

置于干冰上送样。