NA测序(RNA-Seq)是基于二代测序技术开展转录组学研究过程中广泛使用的一种方法,能够在特定时间点对生物样本中的多种RNA进行定性和定量分析。针对RNA测序的常规建库方法都需要先将RNA转换为双链DNA,且需经过目标RNA富集及片段化、双链DNA合成、接头连接、PCR扩增等多个步骤。
Tn5转座酶复合体因能一步打断双链DNA并且使DNA两端带上接头,而广泛应用于二代测序建库等领域。近期也有研究发现,Tn5转座酶同样能以类似的方式作用于RNA/DNA杂合链,从而能够省去传统RNA建库技术中的RNA片段化、二链合成等繁琐的操作步骤,进一步拓展了Tn5转座酶的新用途。此外,Tn5转座酶也被广泛用于体外转基因(外源基因整合到宿主细胞)等各领域。
NGS™ Tn5转座酶是一种来源于E.coli、经过改造具有极高活性的Tn5转座酶突变体,可以高效地将Tn5转座子随机插入到目标序列,对于真核和原核生物的DNA都有极高的转座插入效率。与野生型Tn5转座酶相比,其插入效率至少提升1000倍,具有转座随机性好、稳定性高、插入位点易测序等特点。
产品原理:
本产品可以特异性识别两端含有嵌合末端序列(Mosaic End sequence, ME)的DNA片段(包括含有ME序列的引物),最终形成Tn5转座体,该转座体可以随机结合靶DNA并切割插入其携带的DNA片段。
图1. NGS™ Tn5 Transposase的工作原理图。
产品用途:
二代测序(NGS)文库构建时的片段化和加接头;
将测序引物引入克隆DNA或质粒;
细菌基因敲除库的建立;
新型细菌菌株工程改造;
目的基因的插入失活;
将T7转录启动子、抗性标记等插入靶DNA等。
使用说明:
1.体外转座子插入反应和转化。
a.Tn5转座子的设计。Tn5转座子是两侧带有19bp ME序列的DNA片段,可以使用含有ME序列的上下游引物进行PCR合成。为了获得最佳的转座效率,在两端的PCR引物中需要添加一个5'磷酸基团。典型的Tn5转座子参考图2。
ME序列: 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
图2. Tn5转座子示意图。Tn5转座子其两端为19bp ME序列,ME序列可被BeyoNGS™ Tn5转座酶特异性识别。
b.按照下表制备转座子插入混合物。配制过程中需要注意目标DNA纯度,确保无外源核酸污染。Component | Volume |
Reaction Buffer (5X) | 2μl |
Target DNA* | 0.2μg |
molar equivalent Tn5 Transposon | x μl |
BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) | 1μl |
ddH2O | To 10μl |
Component | Volume |
Tn5 Transposon DNA (100μg/ml in TE Buffer) | 2μl |
BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) | 4μl |
Glycerol (100%) | 2μl |
Total Reaction Volume | 8μl |
Component | Volume |
Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251) | 10μl |
ME (500μM) | 20μl |
Primer-1 or 2 (500μM) | 20μl |
Total Reaction Volume | 50μl |
Step | Temperature |
1 | 95℃, 2min |
2 | 95℃, 8s, -0.1℃ per cycle |
3 | GOTO step 2, 700 cycles |
4 | 4℃ forever |
Component | Volume |
BeyoNGS™ Tn5 Transposase | 10μl |
Adapter 1 (200μM) | 1μl |
Adapter 2 (200μM) | 1μl |
Component | Volume |
DNA | 50-100ng |
Tn5转座体 | 0.5-2μl |
Reaction Buffer (5X) | 4μl |
ddH2O | To 20μl |
图3. 使用NGS™ Tn5 Transposase制备的Tn5转座体用于DNA随机片段化的效果测试图。在20μl反应体系中,加入100ng Lambda DNA及相应量的Tn5转座体,55℃孵育10分钟,反应完毕入5μl Stop Buffer (5X),混匀后55℃孵育5分钟终止反应,加入5μl DNA上样缓冲液(6X) ,使用 琼脂糖预制胶进行电泳检测。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。
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