打开APP
userphoto
未登录

开通VIP,畅享免费电子书等14项超值服

开通VIP
琼脂糖凝胶电泳分离纯化DNA步骤和问题分析

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动,一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb~50kb范围内的DNA片段,三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:超螺旋DNA>线型DNA>开环DNA.

琼脂糖预制胶

一、选择适合的电泳缓冲液:

1、较高浓度的胶有利于提高小分子量核酸的分辨率,常规一般使用TBE缓冲液。(即Tris硼酸盐溶液)

2、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,PH值上升,缓冲性能下降,可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

二、选择适合的Marker:

DNA电泳一定要使用DNA marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker的选择要适中,Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的,这样对目标片段大小的估计才比较准确。如果marker太大就可能跑不开,挤到一起,起不到marker的作用。

三、设备和耗材:移液器、电泳仪电源、水平式凝胶电泳槽、凝胶成像系统、样品、枪头。

四、试剂:10xTBE缓冲液(粉剂)、    DNA相对分子质量标准样品、上样缓冲液。

五、操作步骤:

1、准备:将琼脂糖预制胶去除置于电泳槽中,然后向槽内加入0.5xTBE稀释缓冲液只液面恰好没过凝胶表面;

2、加样:用移液器小心将样品加入点样孔中,上样时要小心不要将点样孔底部凝胶刺穿。

3、电泳:加完样后,连接好电线和电源,注意正负极,接通电源,恒压180V。

4、观察:戴好手套小心取出凝胶,放在干净的塑料膜或者托盘上,置于凝胶成像系统下拍照。

5、清洗:将实验过程中所用电泳设备清洗晾干并置于原位。

六、问题分析:

本站仅提供存储服务,所有内容均由用户发布,如发现有害或侵权内容,请点击举报
打开APP,阅读全文并永久保存 查看更多类似文章
猜你喜欢
类似文章
【热】打开小程序,算一算2024你的财运
琼脂糖凝胶电泳实验
凝胶电泳常见问题分析
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
干货分享:排除万难,成为核酸电泳小达人,跑出一手好胶
琼脂糖凝胶电泳注意事项和常见问题
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳
更多类似文章 >>
生活服务
热点新闻
分享 收藏 导长图 关注 下载文章
绑定账号成功
后续可登录账号畅享VIP特权!
如果VIP功能使用有故障,
可点击这里联系客服!

联系客服