HACS
总结:
抑制剪接体，可以体外建立和培养小鼠全能性干细胞，这种细胞在分子和功能上接近体内2细胞和4细胞时期胚胎，因此被命名为totipotent blastomere-like cells（TBLCs）
文章标题：
Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression
|背景介绍：
剪接体是具有五个核心亚基和几个辅因子的大分子核糖核蛋白（RNP）复合物，并且是信使RNA（mRNA）剪接和成熟的动态分子机器。最近的研究表明，剪接体还可以直接控制转录的起源，延伸和终止，突出了它们的非剪接独立功能。有趣的是，在许多不同的癌症中，已经确定了几种关键剪接因子的突变在肿瘤发生中起着至关重要的作用。但是，剪接体在干细胞命运转变和早期胚胎发育中可能的生理相关性尚不清楚。
胚胎发育受精卵开始，经过2、4、8细胞、桑椹胚，形成囊胚并继续发育形成胚内和胚外组织。胚胎发育过程中细胞在变小，与PlaB对ESC大小的影响一致
具有最高潜能的干细胞被称为全能性干细胞（Totipotent stem cell），一般指体内的合子，2/4C，它们可以发育到胚内和胚外组织。
多能性干细胞（ESC），一般来源于囊胚的内细胞团(ICM)，它的发育潜能是受限的，只能发育到胚内组织。
目前，所有培养的小鼠胚胎干细胞都处于多能状态，人们一直尝试用各种方法在体外建立发育潜能更高的干细胞，也就死2/4C或者受精卵对应的全能性干细胞（Totipotent stem cell）。
表达全能性基因Zscan4s和Mervl的2C-like细胞是最早报道的能够产生胚内和胚外组织的细胞。（Macfarlan, T.S., Gifford, W.D., Driscoll, S., Lettieri, K., Rowe, H.M., Bonanomi, D., Firth, A., Singer, O., Trono, D., and Pfaff, S.L. (2012). Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity. Nature 487, 57–63.）
问题是，2C-like细胞在培养基中是亚稳态的，而且在细胞群里占比很低（0.1％-1％）。
化学小分子混合物也可以用来建立扩展型多能干细胞（Expanded (or extended) pluripotent stem cell，EPSC），具有胚内和胚外双向分化潜能。但是，这种扩展性多能性干细胞的分子特征和功能等方面和体内真正的全能型胚胎细胞仍存在较大差距.(Posfai, E., Schell, J.P., Janiszewski, A., Rovic, I., Murray, A., Bradshaw, B., Ya- makawa, T., Pardon, T., El Bakkali, M., Talon, I., et al. (2021). Evaluating toti- potency using criteria of increasing stringency. Nat. Cell Biol. 23, 49–60.)
迄今为止，人们无法在体外捕获和维持分子和功能上与体内全能性胚胎相似的全能性干细胞，因此也就无法真正利用体外细胞培养体系研究着床前胚胎发育过程，并且导致胚外组织的体外分化及相关转化医学应用等方面也存在极大的局限性。
|核心内容：
1、剪接体抑制驱动多能干细胞到全能干细胞的转变
先前发表的单细胞胚胎数据表明剪接因子在早期胚胎发育过程中是动态变化的，说明胚胎发育与剪接因子有关。有一类剪接因子在胚胎发育早期低表达，在后期表达量逐渐升高。不过没人知道该类剪接因子受谁调控，也不知道该类剪接因子表达的水平对胚胎发育有何影响？
该类剪接因子在胚胎发育早期低表达，这暗示其有利于胚胎的发育分化，换句话说，人为敲低这一类关键剪接因子或许可以提高干细胞的多能性。结果确实如此，这一类关键剪接因子的敲降能广泛激活全能性基因（如Zscan4s，Plk2，Btg1/2以及转座子Mervl和Mt2），同时沉默多能性基因（如Utf1，Tdgf1，Sox2），将小鼠多能性的ESC重编程为全能性状态。
将剪接抑制剂Pladienolide B（PlaB）添加到Serum/ LIF培养基中（SLP培养基），能够在体外培养和维持TBLC，且细胞活性和核型正常。
与PSCs (pluripotent stem cells) (P0)相比，在SLP培养基中培养5代之后，整体转录组趋于稳定，特异性表达胚胎时期的全能性基因，沉默囊胚时期特异性表达的多能性标记基因，接近体内胚胎的2细胞和4细胞时期。
撤去PlaB后，TBLCs细胞能够恢复到多能性状态，说明单个剪接抑制剂PlaB可以操纵这个多能/全能干细胞转换过程。
SLP培养条件提供了一个可靠的体外系统来研究全能到多能细胞的转换，且这个系统在分子水平上能够模拟从体内2细胞时期到囊胚时期的发育。
2、TBLC在单细胞转录组、翻译组、DNA甲基化组和染色质可及性上具有与2细胞和4细胞时期相似的分子特征
作者首先对PSCs和TBLCs进行单细胞转录组测序：用23个多能性标记基因和30个全能性基因以及转座子Mervl和Mt2，区分了PSC和TBLC，发现几乎所有的TBLC都来自SLP培养基，说明SLP培养基能培养和维持TBLC细胞的同质性。
此外，翻译组测序（Ribosomal profiling，Ribo- seq）显示，与PSCs相比，TBLCs在翻译组水平上全能性基因表达上调，多能性标记基因表达下调。
作者使用全基因组亚硫酸氢盐测序法（Whole-Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）来表征PSCs和TBLCs的DNA甲基化组，发现PSCs中的整体甲基化水平为71%，接近E6.5-E7.5时期胚胎；而TBLCs与之相比甲基化水平大幅降低至35%，类似于体内2细胞和4细胞胚胎（整体甲基化程度分别为47%和41%）。
染色质可及性测序ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）结果显示，与PSCs相比，TBLCs在转录起始位点（TSS）附近的开放峰和封闭峰与小鼠2细胞和4细胞胚胎时期显示出相似的开放或封闭状态，这意味着TBLCs具有与早期胚胎相似的染色质可及性。
3、TBLC与EPSCs和2C-like细胞不同，在分子水平上靠近2细胞和4细胞时期胚胎
作者比较了TBLCs与已发表的EPSCs和2C-like细胞的转录组测序数据，发现与TBLCs细胞中大多数多能性标记基因被广泛沉默不同，EPSCs仍明显表达多能性标记基因；而在TBLCs中高表达的全能性基因或转座子在EPSCs中表达量很低。
对TBLCs和EPSCs与小鼠植入前胚胎数据进行了基于转录组的主成分分析以及与2C-like细胞的相关性分析，发现TBLCs明显靠近2细胞和4细胞时期胚胎，EPSCs和2C-like细胞接近多能性囊胚时期。
4、TBLC具有双向分化潜能，能够产生多种胚内和胚外细胞谱系
功能嵌合实验表明，TBLC具有强大的双向发育潜能，可以产生胚内和胚外组织，包括囊胚时期的TE，E6.5-E7.5胚胎的EPC和ExE，以及发育后期的胎盘和卵黄囊。
更重要的是，作者还观察到来源于单个TBLC的荧光标记细胞可以嵌合进入整个E6.5-E7.5胚胎，包括EPI，ExE和EPC。
小鼠胎盘是一个富含血液的复杂器官，为了避免免疫染色产生的假阳性，作者将E13.5嵌合小鼠的胎盘和卵黄囊消化成单细胞，并通过流式富集筛选出有荧光标记的TBLC来源的细胞进行单细胞测序，发现其能够在小鼠体内分化为至少6种胚外和15种胚内细胞类型。
该实验首次利用单细胞转录组准确追踪出供体细胞的发育谱系，为全能性细胞的功能性检验提供了一个更严格的检验方法。作者使用单细胞测序，证明了TBLC能够在胎盘和卵黄囊中分化为至少6种胚外和15种胚内细胞类型。
在机制上，剪接体阻遏导致广泛的内含子积累，从而导致多能性基因表达下降，而几乎不含短内含子的全能基因被有效剪接并转录激活。
综上，此项研究首次建立了体外捕获和培养全能性干细胞的方法，揭示了剪接体在干细胞命运转变中的决定作用。
-原文摘要-
Since establishment of the first embryonic stem cells (ESCs), in vitro culture of totipotent cells functionally and molecularly comparable with in vivo blastomeres with embryonic and extraembryonic developmental potential has been a challenge.
Here we report that spliceosomal repression in mouse ESCs drives a pluripotent-to-totipotent state transition.
Using the splicing inhibitor pladienolide B, we achieve stable in vitro culture of totipotent ESCs comparable at molecular levels with 2- and 4-cell blastomeres, which we call totipotent blastomere-like cells (TBLCs).
Mouse chimeric assays combined with single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) demonstrate that TBLCs have a robust bidirectional developmental capability to generate multiple embryonic and extraembryonic cell lineages.
Mechanically, spliceosomal repression causes widespread splicing inhibition of pluripotent genes, whereas totipotent genes, which contain few short introns, are efficiently spliced and transcriptionally activated.
Our study provides a means for capturing and maintaining totipotent stem cells.
------------------------------------------------------------参考文献：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)00500-6
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