小麦抗白粉病新种质Tamlo-R32分子标记辅助选择育种

2022年2月10日，中国科学院微生物所团队和遗传发育所团队合作在Nature杂志发表题为“Genome edited powdery mildew resistance in wheat without growth penalties”的研究长文(Li et al. 2022)，阐明了小麦新型mlo突变体Tamlo-R32既抗白粉病又高产的分子机制；并通过基因组编辑技术对小麦高产品种科农199、西农511、石4185和小偃60中TaMLO基因进行精准操控，快速获得广谱抗白粉病又高产的小麦新品系。与传统的分子辅助育种相比，基因组编辑技术可以将回交转育年限由原来的几年缩短到几个月，为mlo基因在小麦抗白粉病育种中的实际应用提供了新路径。我们课题组参与了其中利用主栽品种对新型mlo突变体Tamlo-R32的回交转育工作，本文介绍在回交改良过程中进行分子标记辅助育种的几点经验、教训和思考。

mlo是最早在大麦中发现的广谱抗白粉病基因。早在2014年中国科学院微生物所邱金龙和遗传发育所高彩霞团队合作在Nature Biotechnology杂志上发表研究成果，利用基因组编辑技术定向突变小麦品种Bobwhite中的3个感病基因TaMLO，获得了对白粉病具有广谱持久抗性的材料(Wang et al. 2022)，展示了基因组编辑在复杂基因组农作物育种中巨大的应用潜力。然而，正如在其它多种植物中观察到的表型一样，研究人员也发现小麦mlo突变体在表现出白粉病抗性的同时，也出现了早衰、植株变矮、产量下降等负面表型，从而限制了其在生产上的应用。幸运的是，他们在大量的基因组编辑小麦突变体中筛选获得了一个mlo突变体Tamlo-R32，该突变体对白粉病免疫，同时生长发育和产量表现正常。进一步对Tamlo-R32中TaMLO基因进行序列分析，只发现在TaMLO-A1(5AL)和TaMLO-D1(4DL)位点存在基因编辑突变，其中TaMLO-A1基因编码区的靶位点存在一个2 bp的删除和一个53 bp的插入，TaMLO-D1基因编码区的靶位点存在一个32 bp的删除，但TaMLO-B1(4BL)位点的基因编辑情况未知。为了将研究成果尽快应用于抗病育种，我们决定利用Tamlo-R32突变体与4个高产小麦底盘品种济麦22、良星99、农大399和农大2011进行杂交，应用分子辅助选择结合传统加代回交育种的方法将Tamlo-R32白粉病抗性引入高产小麦遗传背景。

Tamol-R32与底盘品种第一次杂交在中科院遗传发育所温室加代完成，以Tamol-R32为母本，底盘品种为父本进行杂交，每个组合做了5个杂交穗，但由于当时温室条件影响，平均每个杂交穗仅结实5粒左右。收获的F₁种子TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1位点基因型都为杂合，当代并不需要进行分子标记检测。以F₁为母本，底盘品种为父本进行了第一次回交，每个组合平均做5个杂交穗，每个组合收获BC₁F₁代杂交种70粒左右，就需要进行分子标记辅助选择了。由于缺乏可用的TaMLO-B1编辑位点特异标记，仅以TaMLO-A1和TaMLO-D1编辑位点特异的分子标记进行了检测，选育TaMLO-A1和TaMLO-D1两个位点基因型均为杂合的单株进行下一代回交，这些基因型杂合的单株频率约在25%左右。继续回交BC₂F₁的杂交种收获之后，Tamlo-R32的TaMLO-B1位点研究取得突破性进展，发现在TaMLO-B1 编辑位点附近存在约304 kb的大片段删除，致使TaMLO-B1功能丧失，进而赋予了Tamlo-R32白粉病抗性。这个结果使得开发TaMLO-B1编辑位点特异性标记成为可能，对BC₂F₁回交世代的基因型检测变得尤为紧迫，因为TaMLO-B1 位点一直未进行分子标记辅助选择，很容易造成该位点的丢失。同时，农大399、济麦22和良星99还携带Pm2或Pm52抗白粉病基因，单纯利用白粉病抗性鉴定还不能有效进行Tamlo位点的选择。通过对BC₂F₁回交种子的基因型进行检测，发现以这4个底盘品种为背景的TaMLO-B1位点确实没有得到有效选择，在所有的后代单株中该位点均丢失了。

图1 Tamlo基因3个亚基因组编辑位点的分子标记检测

由于当时保留了第一次杂交收获的F₂种子，不得已只能在F₂群体中选择含有Tamlo突变位点的单株进行第二次回交转育。因为需要对TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1这3个编辑位点同时进行选择，需要的群体规模和工作量都以2的指数倍增长。原来的回交BC₂F₁种子中2位点基因型均为杂合的概率为25%，3位点基因型均为杂合的概率为12.5%，而在F₂代进行选择的阳性单株频率又大大降低。

为同时兼顾筛选3个编辑位点以及农艺性状，我们从Tamlo-R32与济麦22和良星99的杂交F₂群体中各检测了300左右单株，选择了A和D位点均为纯合突变，B为杂合位点的单株进行了下一次的回交转育(B位点未检测到纯合突变，大片段的缺失可能造成该位点的偏分离)，其中与济麦22杂交后代检测到5株，与良星99杂交后代检测到3株同时含有3个基因组编辑位点的单株进行下一次回交。

通过两次与底盘亲本杂交和自交，在846株良星99背景的BC₂F₂后代中，检测到6株TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1这3位点都为纯合突变单株，其概率为0.7%。在683株济麦22背景的BC₂F₂后代检测到2株TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1这3位点都为纯合突变的单株，其概率为0.3%。在温室条件下对济麦22和良星99背景的3位点纯合单株进行了农艺性状和产量性状测定，发现其株高和单株产量与良星99和济麦22相当，差异不显著。通过接种对良星99和济麦22均有毒性的白粉病菌系，发现良星99和济麦22均表现感病，纯合3位点编辑单株表现免疫。至此通过几代分子标记辅助回交转育，将Tamlo-R32突变体抗白粉病性状引入到主栽小麦品种，实现了其育种应用。

图2  Bobwhite、Tamlo-R32、济麦22和济麦22^Tamlo-R32成株期性状表现

通过对Tamlo-R32突变体进行回交转育，我们有以下几点经验和体会：

首先，对育种目标性状的遗传解析是分子标记辅助选择育种成功的关键。分子标记辅助选择的目的是选择育种目标性状的基因型，所以必须对育种目标性状的遗传基础进行解析，并获取控制育种目标性状的主效基因/QTL。Tamlo-R32是利用基因组编辑技术对春小麦受体亲本Bobwhite的TaMLO的三个部分同源基因TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1进行基因敲除，创制的小麦抗白粉病新种质。其5A、4B和4D亚基因组的TaMLO位点同时存在基因组编辑突变，这些基因位点变异导致了TaMLO功能丧失，也赋予了R32抗白粉病的功能。早期开展回交转育工作时，由于还不清楚B基因组位点的缺失片段有多大，没有对应的分子标记，只能对TaMLO-A1和TaMLO-D1位点进行了分子辅助选择，结果造成TaMLO-B1位点的丢失，使得回交育种工作走了许多弯路。

其次，开发可用于目标性状基因检测的“育种友好型”分子标记。利用分子标记辅助选择育种对单个基因进行改良或多个基因聚合改良，分子标记检测准确性是关键，最好是基因的功能标记。根据TaMLO的三个部分同源基因TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1基因敲除位点的Insertion/deletion特性，开发出基于聚合酶链式反应(PCR)和可用于凝胶电泳检测的分子标记，应用于Tamlo-R32分子标记辅助选择育种中。由于Tamlo-R32的特殊性，共需要开发4对标记，具体如下：在TaMLO-A1和TaMLO-D1基因敲除位点设计跨越Insertion/deletion的特异检测标记；在TaMLO-B1基因敲除位点标记设计时，由于存在304 kb的大片段删除，需要设计跨越大片段删除区间的分子标记，同时还设计了304 kb的大片段区间序列特异检测的分子标记，两个标记同时检测以确定目标单株的基因型。由于Tamlo-R32在常规杂交育种和回交转育过程中要同时对3个隐性基因位点进行选择和聚合，所以每个世代都需要足够大的回交分离群体才能选择到需要的目标单株进行回交转育。

最后，分子标记辅助选择还需要兼顾农艺性状选择。在突变体Tamlo-R32的回交转育过程中，供体亲本为Bobwhite背景的红粒春麦品种。底盘亲本是济麦22和良星99等白粒半冬性品种。同时济麦22和良星99中还含有Pm2和Pm52基因，由于Tamlo为隐性抗白粉病基因，在回交转育过程中通过田间或温室接种白粉病菌的方法辅助选择成为难题。另外，在分子标记辅助选择转育过程中，每个世代的单株都要进行分子标记检测，以确定各单株目标基因的基因型，同时选择3个位点均为杂合基因型的单株进行去雄回交。在回交转育过程中还要兼顾种皮颜色和半冬性等农艺性状选择。

分子标记辅助选择与常规育种相比,可以更有效地结合基因型与表现型鉴定, 显著提高选择的准确性和育种效率。但在育种实践中，利用分子标记进行辅助选择，通常需要进行大规模的群体标记基因型分析，因而要求标记基因型检测方法具有简单、快速、准确、成本低廉、检测过程(包括DNA提取、分子标记的检测、数据分析等)自动化的特征，时间和检测成本的节约还需要新技术的突破，尤其是Tamlo需要对3个亚基因组均为隐性位点的选择更为困难。而植物基因组编辑技术可以跳过常规育种和分子标记辅助选择育种等繁琐的常规育种环节，通过直接编辑育种目标基因，在高产优质品种遗传背景下快速创制育种新种质，极大地缩短了育种年限，显示出其在作物分子设计育种中的巨大潜力。

参考文献

1. Li Shengnan, Lin Dexing, ZhangYunwei, Deng Min, Chen Yongxing, L v Bin, Li Boshu, LeiYuan, Wang Yanpeng, ZhaoLong, Liang Yueting, Liu Jinxing, Chen Kunling, Liu Zhiyong, XiaoJun, QiuJin-Long and Gao Caixia. Genome-edited powdery mildew resistance in wheatwithout growth penalties. Nature (2022). doi.org/10.1038/s41586-022-04395-9

2. Wang Y, Cheng X, ShanQ, et al. (2014) Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology, 32(9):947.