COVID-19的血清学检测方法概述

2020-7-2| 编辑: 班木芙兰|来源: 赛默飞科学

摘要: 北京6月25日发布的病例中，北京大兴一名60岁女子确诊前四次核酸检测均为阴性；6月26日发布的病例中，有3个病例核酸检测阴性，但血清抗体检测为阳性，最终被确诊。那么，核酸检测准确性到底如何？血清抗体检测是必须 ...

北京6月25日发布的病例中，北京大兴一名60岁女子确诊前四次核酸检测均为阴性；6月26日发布的病例中，有3个病例核酸检测阴性，但血清抗体检测为阳性，最终被确诊。那么，核酸检测准确性到底如何？血清抗体检测是必须的吗？

让我们先看看病毒感染不同阶段的检测方法。

病毒感染不同阶段的检测方法

从上图可以看出，针对窗口期的病人，病毒抗原检测合并核酸检测可以获得更早的有诊断意义的数据。

病毒抗原检测方法主要包括酶联免疫（ELISA），胶体金和磁微粒化学发光。由于酶联免疫具有操作简单、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、能定性及半微量、微量、超微量定量分析，是目前应用最广的免疫诊断方法。

ELISA的基本原理

接下来，我们以三篇文献为例，来看看SARS-CoV-2抗体血清学检测究竟是如何进行的。

SARS-CoV-2抗体血清学测试方案流程图

Current Protocols in Microbiology, 2020

这篇文章中，我们可以清楚地看到抗体血清学检测流程。文章中首先拿到了分泌型的RBD蛋白和可溶性SARS-CoV-2 spike protein三聚体。其中RBD表达水平大于20mg/L，全长的Spike蛋白表达水平相对较低（1mg/L）。因此，文章中使用重组RBD蛋白进行ELISA初筛，使用Spike蛋白对初筛的阳性样品进一步确认。

整个流程分两部分：第一部分先从质粒构建开始，到拿到目的蛋白为止。

首先是质粒构建，构建好的质粒转染到HEK 293F中进行蛋白表达。293F细胞使用Expi293培养基（Gibco # A1435102）进行培养，Expifactamine293转染试剂（Gibco # A14524）进行转染，细胞培养和转染步骤按照产品说明书进行。转染三天后收获目的蛋白（RBD或Spike）。

第二部分使用两步法ELISA进行高通量血清学筛选。

第一步使用RBD蛋白进行高通量血清样本ELISA初步筛选，从中选出的阳性样本，会进行第二步Spike蛋白ELISA确证筛选。第二次Spike筛选过程中，会将血清样本进行梯度稀释，从中选出的阳性样本，即最终确认的阳性样本。当然，在只有一种蛋白的情况下，也可以只进行一轮ELISA筛选。

整个检测流程中，可能遇到最大的困难就是抗原表达量不够高，不足以支持大规模的免疫诊断研究。而上文中使用的Expi293表达系统，能够明显提高抗原表达量。让我们再看两篇文章。

同样是进行可溶性SARS-CoV-2 spike protein三聚体表达，针对于这种糖基化比较复杂，长度比较长的病毒膜蛋白（抗原）的表达，传统的表达水平在0.5mg/L，经过优化使用Expi293系统蛋白表达量可以达到5mg/L。

此外，赛默飞还提供了ExpiSf昆虫表达系统，用于抗原或是受体的表达。

Expi293 – 可信赖的、快速、高产的瞬时 HEK 293 表达的行业标杆产品

在表达蛋白时，时间因素至关重要。这就是 Gibco Expi293 表达系统能成为 293 细胞瞬时表达的可靠选择的原因。这种快速、高产的系统可以让您在短短的五到七天内获得 293 来源重组蛋白，从而更快地获得所需的产物。

ExpiSf - 首个化学成分确定的昆虫表达系统

赛默飞还提供首个化学成分确定的昆虫表达系统——ExpiSf表达系统。

ExpiSf表达系统是一个具有超高蛋白得率的全集成系统，一个步骤实现杆状病毒从生产到蛋白表达。多次表达运行间、多个细胞传代间具有一致的结果。

除抗原表达之外，对于诊断抗体的表达和生产，赛默飞也提供杂交瘤表达培养基和ExpiCHO表达系统。

Gibco杂交瘤无血清培养基

Hybridoma-SFM 是蛋白质含量很低（含有 μg/ml 胰岛素和转铁蛋白形式的蛋白质）的培养基，适合多种杂交瘤的生长和单克隆抗体的生产。

● 大多数杂交瘤仅需要依次进行少量驯化或者不需要驯化

● 非常低的蛋白质含量有助于单克隆抗体纯化

Gibco杂交瘤CD培养基

杂交瘤CD培养基是一种无动物源的、化学成分明确的、无蛋白的培养基，专门用于支持杂交瘤的生长以产生抗体。

● 支持悬浮和贴壁的杂交瘤和骨髓瘤生长

● 不含L-谷氨酰胺的稳定性配方

● 无动物源，无蛋白质，化学成分明确

ExpiCHO - 从研究到生物转化过程中保持蛋白质的质量和功能

在药物开发过程中，从293细胞替换为CHO细胞可能会花费很多宝贵时间，并且带来不确定性。

使用Gibco ExpiCHO表达系统能够在更小的培养体积中获得高达20x的蛋白产量，达到瞬时系统的最高蛋白得率，灵活适应开发过程的各个阶段。这意味着从研究开始，您就可以一直使用 CHO 细胞。

参考文献：

●A detailed protocol for a serological assay to detect SARS-CoV-2 1 seroconversion in humans: antigen production and test setup

●Standardization of enzyme-linked immunosorbent assays for serosurveys of the SARS-CoV-2 pandemic using clinical and at-home blood sampling

●Optimizing high-yield production of SARS-CoV-2 soluble spike trimers for serology assays

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