MSCs不仅可以下调免疫应答强度以调节机体的先天性免疫与适应性免疫,而且还可以促进血管生成、抑制细胞凋亡。近几年,MSCs已然成为生命科学研究的热点之一。然而,MSC细胞的培养却非易事,成功建立可靠的MSC细胞培养操作体系往往需要处理好各种操作细节。
对脐带分离MSC细胞的实操感兴趣的朋友,可以点击链接:历史文章-脐带分离原代MSC细胞操作步骤
MSC细胞复苏
1、仪器设备、耗材及试剂
仪器设备:超净工作台一台、二氧化碳培养箱一台、水浴锅一台、低温离心机一台、显微镜一台、1mL电动移液枪、电动移液器。
耗材:镊子、15mL离心管、细胞培养瓶、10mL移液管。
试剂:MSC培养基础培养基、MSC培养完全培养基、台盼蓝染色液。
2、细胞复苏操作步骤
实验前准备
细胞培养基置于4℃平衡,水浴锅预先调至37℃,离心机开机预冷至4℃。
细胞复苏
a. 从液氮罐中取出冻存管,如有液氮渗漏进冻存管内,先稍微拧松管盖,让气化的液氮逃逸(否则冻存管有爆炸危险)。
b. 用镊子夹住冻存管,浸入37℃温水中(注意管口不要浸入液面以下),并不时摇动,待管中冰核溶解至黄豆粒大小时拿出,酒精擦拭后转移至超净工作台内。
注:该步骤对细胞存活率至关重要,既要尽快融化,减少融化过程对细胞的损害,又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间,以减少DMSO对细胞的毒害,切不可将冻存管放在水浴锅中不管。
c. 将冻存管内细胞悬液(约1mL)转移至装有(约14ml)4℃预冷MSC培养基础培养基的15mL离心管中,上下颠倒混匀(所有操作轻柔缓慢,以防损伤细胞)。
d. 4℃,210g,离心4min,吸去上清液,加入1mL MSC培养完全培养基重悬混匀。
e. 取出10uL细胞悬液用PBS稀释一定的倍数,取10μL稀释后的细胞悬液加入台盼蓝染色液,显微镜下计数;根据计数结果及所使用培养基推荐的接种密度(如使用达优GF20培养基,推荐接种密度4000-5000个cells/cm2)计算所需细胞悬液体积。
f. 用移液枪轻柔吹打几次细胞悬液,避免细胞聚团导致细胞接种不均匀。培养瓶中加入适量完全培养基,再加入计算好体积的细胞悬液。将培养瓶置于工作台上,“8”字形前后左右轻晃多次,使细胞在培养瓶中均匀分布。将培养瓶放入37℃ CO2培养箱中进行培养。
MSC细胞传代
1、实验设备、耗材及试剂
仪器设备:超净工作台一台、二氧化碳培养箱一台、显微镜一台、水浴锅一台、低温离心机一台、1mL电动移液枪、电动移液器。
耗材:15mL离心管、细胞培养瓶、10mL移液管。
试剂:MSC培养完全培养基、胰酶、DPBS、台盼蓝染色液。
2、传代操作步骤
实验前准备
将MSC培养完全培养基避光平衡至室温。
细胞传代
a. 从培养箱中取出细胞培养瓶,显微镜下观察细胞汇合度、形态等,并进行记录拍照(根据需要,拍摄倍数40倍或100倍)。
b. 汇合度80%-90%时即可进行消化传代(汇合度过高会影响细胞后续状态)。
c. 酒精棉球擦拭细胞培养瓶后(注意酒精不要进入瓶盖内膜上),转移至工作台内,移去细胞培养瓶内培养基。
d. DPBS清洗细胞培养瓶1-2次,每次2-3mL(视培养瓶大小而定)。
e. 加入胰酶消化液 500μL(不同大小培养瓶胰酶用量参考表1),拧紧瓶盖,稍微倾斜瓶身,使胰酶均匀覆盖瓶底,37℃培养箱放置30s-1min,肉眼可见细胞呈白茫状脱落,显微镜下观察细胞大部分脱落后,尽快放回工作台。向细胞培养瓶中加入MSC培养完全培养基终止消化(培养基体积大于加入胰酶体积的3倍即可,应及时进行终止,避免消化过度)。
MSC培养完全培养基与胰酶的推荐用量
f. 如有未脱落的细胞,使用移液管轻微吹打几次瓶壁,使细胞脱落。将细胞悬液转移至15mL离心管中,210g室温离心4min。
g. 离心后,可见管底出现白色沉淀,酒精球擦拭离心管后转移至工作台内。移去上清,加入适量新鲜的MSC培养完全培养基重悬细胞(500μL-1mL左右),用移液枪量出管内总体积数,可将体积数写在对应管盖上,取出10μL进行台盼蓝计数。
h. 根据计数结果及所使用培养基推荐的接种密度,计算所需细胞悬液体积。具体接种密度视细胞代数、增殖速率、实验所需传代天数而定(根据实验经验来),通常建议三天传代一次较为合适,可以保证细胞达到最高的增殖效率。
i. 用移液枪轻柔吹打几次细胞悬液,避免细胞聚团导致细胞接种不均匀。细胞培养瓶中加入适量MSC培养完全培养基,再加入计算好体积的细胞悬液。将细胞培养瓶置于工作台上,“8”字形前后左右轻晃多次,使细胞在培养瓶中均匀分布,后放入37℃ CO2培养箱中进行培养。
MSC细胞冻存
1、实验设备、耗材及试剂
仪器设备:冰箱一台、液氮罐一个、显微镜一台、低温离心机一台、1mL电动移液枪、电动移液器。
耗材:15mL离心管、10mL移液管、细胞冻存管、细胞程序降温冻存盒。
试剂:MSC培养完全培养基、无血清细胞冻存液。
2、冻存操作步骤细胞
实验前准备
a. 细胞冻存管放入-20℃平衡,细胞程序降温冻存盒、MSC培养完全培养基、无血清细胞冻存液放入4℃平衡。
b. 将备用的细胞冻存管做上详细的记号,比如细胞代次、冻存时间、冻存密度等。
细胞冻存
a. 对要冻存的细胞按照上述传代操作中的实验步骤进行消化处理,将细胞悬液加入15mL离心管中4℃,210g,4min,加入适量4℃平衡过的MSC培养完全培养基(500μL-1mL左右)进行重悬计数。
b. 根据细胞计数的结果加入4℃平衡过的的MSC培养完全培养基(冰上操作),将细胞浓度调整至冻存所需的密度(即冻存液推荐的密度)。如使用达优2X无血清细胞冻存液,推荐的冻存细胞密度为1×106-1×107 cells/ mL 。如果冻存密度为1×106 cells/mL,即用培养基将细胞密度调整为2×106cells/mL。
c.(冰上操作)缓慢逐滴加入冰浴过的无血清冻存液(加入的体积参考所使用的的冻存液说明书,如使用达优无血清细胞冻存液,此处为等体积加入),轻轻混匀(注意:一定要逐滴加入,以避免溶液中DMSO浓度的剧烈变化,引发细胞损伤)。
d. (冰上操作)以每管1mL细胞悬液的量分装入在经-20℃平衡过的细胞冻存管,然后将细胞冻存管的盖子拧紧。
e. 立即将冻存管放入已在4℃平衡过的细胞程序降温冻存盒,然后将该冻存盒放入-80℃冰箱。
f. 过夜后,将细胞转移至在液氮罐中,并在液氮设备管理单上记录细胞的放置位置。
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