·导语·
“魔剪”CRISPR在基因编辑领域一直都是炙手可热的，CRISPR技术相关的文章层出不穷，最近更是屡次霸占科研界的头条，掀起巨大波澜。今天小鱼将最近CRISPR技术取得的突破进展做一个盘点。
当DNA发生损伤时，细胞会利用同源指导修复（HDR）或者非同源末端链接（NHEJ）来修复DNA。HDR可重建或替换受损基因，修复更为精确，在细胞分裂过程中起着重要的作用；而NHEJ则通过降解受损基因，重新连接剩下的片段末端来修复DNA，一般当细胞停止分裂时，细胞通常会采用NHEJ而非HDR来修复受损DNA。
由于大脑中神经细胞不再分裂，CRISPR可相对容易的敲除大脑中某些基因，却很难通过HDR精确的将目的基因替换受损基因，这便是强大的CRISPR系统在修复脑细胞DNA方面少获成功的原因。
该研究小组开发了一种命名为SLENDR（通过CRISPR/Cas9介导的同源指导修复单细胞标记内源性蛋白）的方法来精确改造活体样品中的神经元DNA。在实验模型中，该研究小组利用了子宫内电穿孔技术在发育及分裂的胎儿期脑细胞（断裂DNA仍可通过HDR进行修复）中导入了CRISPR/Cas系统，并同时在同一细胞中用不同的颜色标记两种不同的蛋白。因而，SLENDR提供了一种确定蛋白质的亚细胞定位的方法，有助于确定蛋白质的功能。
参考文献：High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization inMammalian Brain by In Vivo Genome Editing
当将表型性状绘制到基因组上特异性位点时，研究人员通常依赖于细胞减数分裂期间染色体的自然重组来推断对应基因位置，然而传统的方法需要进行多代观察，且在绘制遗传图分辨率时，受限于重组时交换的最短序列长度（可能包含几个基因或基因变异体）。
而该研究团队则利用CRISPR系统在酵母细胞有丝分裂期间进行靶向重组事件，如上图所示，即用CRISPR系统在一条染色体上引入双链断裂，且通过HDR方式进行DNA重组修复，进而产生酵母染色臂的杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH），而后能快速鉴定出导致这种表型的特定基因变异体。同时，研究人员利用该方法精确将Pmr1蛋白（一种锰转运体）定位于一个单核苷酸多态性（SNP）上。
参考文献：CRISPR-directed mitotic recombination enables genetic mappingwithout crosses
尽管CRISPR/Cas系统成为了一种广泛应用的技术，但是其脱靶性及导向RNA易形成二级结果等问题仍然限制该系统的实用性。而韩春雨研究团队从古细菌里获得的Argonaute（简称NgAgo），可利用短链DNA（24个核苷酸组成5’磷酸化单链DNA）作为向导，能有效形成位点特异的DNA双链缺口。
相比于CRISPR/Cas系统，gDNA合成简单（PCR法）且可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。其次，Cas基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制；而NgAgo对靶点选择没有限制，对基因组的任何位置都能有效引入双链断裂。再者，由于导向核酸是DNA而非RNA，避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或脱靶效应。最后，NgAgo能对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率。
因而，这个中国首创的尖端生物技术，有望成为取代CRIPSR系统的最新基因编辑技术。
参考文献：DNA-guided genome editing using the Natronobacteriumgregoryi Argonaute
该研究团队通过随机插入突变对Cas9结构进行了全面分析，鉴定了这种蛋白基因的改造热点，这些位点可耐受PDZ结构域的插入，且不影响Cas9的结合和剪切功能。研究人员将雌激素受体α配体结合结构域插入到改造热点中，构建了别构调节的Cas9。该蛋白在原核和真核细胞中表现出了配体依赖的激活，是一种能够诱导可逆Cas9活化的通用型单组分体系，有助于生成新型的Cas9用于基因编辑。
参考文献：Profiling of engineering hotspotsidentifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch
大多数遗传疾病多源于单核苷酸的突变（点突变）。目前CRISPR系统中，因Cas9蛋白中含有两个核酸酶结构域，则会在目标DNA序列上形成双链断裂。因而，在用CRISPR系统校正单个核苷酸时效率比较低，且会在目标位置频繁引入随机插入/缺失基因（Indels）。
为了提高修正点突变的效率，同时也减少插入/缺失的频率，研究人员通过将碱基修饰酶（APOBEC1）构建至Cas9中，使其在结合至目标DNA后，能直接将胞嘧啶（C）转换成尿嘧啶（U）（尿嘧啶与胸腺嘧啶T的碱基配对方式一致）。该研究团队还通过阻碍细胞正常修复DNA的过程，使得目标C-G（鸟嘌呤）碱基对转变成T-A（腺嘌呤）碱基对。同时，该研究小组利用改造后的Cas9纠正了小鼠细胞中阿尔茨海默病相关突变（有效率高达75%）和人类细胞中癌症相关基因的突变（有效率高达7.6%）。
参考文献：Programmable editing of a target base in genomic DNA withoutdouble-stranded DNA cleavage
Emmanuelle的研究团队发现了Cpf1对RNA和DNA具有双重切割活性。不同于CRISPR-Cas9,Cpf1能以自身加工前体crRNA，随后利用加工的RNA特异性地靶向和切割DNA，且不需要宿主来源的核糖核酸酶（RNase）及TracRNA，这可能打开了对特定序列基因组编辑和沉默的新方向。
张锋的研究团队揭示了Cpf1/向导RNA/靶DNA复合物的晶体结构，分辨率达到2.8埃（Å）。Cpf1是一种二裂片（bilobed）结构，包含RuvC结构域和一个核酸酶结构域，可将RNA-DNA异源双链核酸分子束缚在中间通道内。同时Cpf1可借助一些碱基和形状读取机制来识别5’-TTTN-3’PAM，为RNA引导Cpf1切割DNA机制提供了一些新见解。
而黄志伟教授的研究团队则首次揭示了CRISPR-Cpf1识别crRNA的复合物结构，Cpf1并不是此前人们推测的二聚体状态，它本身是一个呈三角形的单体，位于该结构中间是一个带有正电荷的凹槽。Cpf1在没有crRNA结合的状态下处于松散的构象，而短小crRNA的结合引起Cpf1发生显著的构象变化。与Cas9结合长sgRNA极为不同的是，仅仅crRNA的重复序列就能引起Cpf1构象的巨大变化。
参考文献：
The CRISPR-associated DNA-cleaving enzymeCpf1 also processes precursor CRISPR RNA
CrystalStructure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA
The crystal structureof Cpf1 in complex with CRISPR RNA
该研究团队设计了一种叫做PAMmer的独特短核酸，使得Cas9能够在不损伤靶分子的情况下有效的识别RNA而非DNA。同时，他们还利用了一种无催化活性的Cas9酶避免切割转录组，并用一种荧光蛋白标记Cas9在显微镜下监测了RNA的活动。最后，该研究团队用一种优化的sgRNA改善了靶向RNA的效率，并能在活细胞中追踪RNA，且不会改变RNA的丰度或翻译蛋白的量。
参考文献：Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9
目前，大规模的基因干扰仍是借助于RNAi来实现的，但是这种方法受限于混乱的脱靶活性及易变的基因敲除效率。CRISPRi则是通过无酶活性的Cas9（dCas9）融合KRAB转录抑制结构域，并不切割靶基因，而是在dCas9靶向转录起始点（TSS）时降低靶基因的表达。这两个技术均能被应用于全基因组的遗传筛查。
为了比较不同技术平台的相对性能，该研究人员挑选出了预期具有一致表型的46个必需基因和47个非必需基因，通过实验完成必需和非必需基因筛查，比较了CRISPR/Cas9系统、CRISPRi系统和shRNA系统，其实验结果证明了CRISPR/Cas技术最优，具有低噪音，最小的脱靶效应及试剂间一致的活性。
参考文献：Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essentialgenes
一大波科研资源来了
解螺旋放送帮你事半功倍的作图软件、相关视频教程、文献管理工具、SCI收录期刊影响因子列表···转发文章到朋友圈，截图后加解螺旋.小小编（微信号：helixlife6）为好友索要即可，赶紧行动吧！
联系客服
