Real-Time PCR：从原理到步骤详解、再到终极数据分析

作者：解螺旋·猫大

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导语

小伙伴们，今天我们来解析一下 Real-Time PCR，从原理到步骤详解再到数据分析，一个都不能少！

在正式开讲之前呢，猫大必须要安利一个网址： http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ 。对，这就是著名的哈佛引物库！

目前 PrimerBank 收录了超过 306,800 对 Real-Time PCR 引物，涵盖了大部分人类和小鼠基因。小伙伴们可以用 GenBank Accession，NCBI protein Accession，NCBI Gene ID，Gene Symbol，PrimerBank ID 或者关键词去库里搜索引物。而且还整合了blast 功能，可以拿目的基因序列去 primerbank 的数据库里进行blast。据说其中收录的 26,855 对小鼠引物经过 Real Time PCR 验证后，其中 22,187 对引物是可用的，成功率有82.6%！！！但是猫大建议小伙伴们，在库里搜索到引物之后呢，别忘了用 oligo 6 评价一下引物，多练习一下 oligo 6 的使用也是很好的嘛。

好，下面开讲 Real-Time PCR，我们就从 Real-Time PCR 的发展史说起，包括 Real-Time PCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解 Real-Time PCR 。由于内容比较多，这五个部分会分成 3 讲。首先是 Real-Time PCR 的原理，实验设计和实际操作。

Real-Time PCR 发展史

Real-Time PCR 的技术的发展是伴随着 Real-Time PCR 仪的研制。1995 年，美国 ABI 公司（已经并入 Invitrogen 公司）成功研制了 Taqman 技术，并推出了首台荧光定量 PCR 检测系统 7700，通过检测每个循环的荧光强度对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以以 Ct 值可进行表达定量。由于 Real-Time PCR 能克服常规 PCR 的缺点，并且具有操作简便，灵敏度高，重复性好等优点，因此发展非常迅速，从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。

Real-Time PCR 实验原理

实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线，以实现对 PCR 进程进行实时检测。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。

Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR 循环次数。Ct 值跟初始模板的量成反比。 第 3-15 个循环的荧光值就是基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的 10 倍。

实验设计

对于 Real-Time PCR 而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后是引物设计；最后是实验和数据分析（这一部分单独说明）。

1. 实验材料的处理和准备

在第一讲 RNA 抽提中已经讲过一些，还需要注意的是， 以最基本的基因表达差异分析为例，实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有复孔，要有生物重复，这样可以统计分析此处理是否有统计学意义。

2. 引物设计

一般Real-Time PCR 引物的设计遵循下面一些原则：

• 扩增产物长度在 80-150bp。

• 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

• 产物不能形成二级结构。

• 产物长度一般在 15-30 碱基之间。

• G+C 含量在 40%-60%之间。

• 碱基要随机分布。

• 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。

• 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。

• 引物 5’端可以修饰。

• 引物 3’端不可修饰。

• 引物 3’端要避开密码子的第 3 位.

Taqman 探针的设计稍有不同，遵循以下原则：

• 尽量靠在上游引物；

• 长度 30-45bp，Tm 比引物高至少 5℃；

• 5’端不要是 G，G 会有淬灭作用，影响定

操作过程

1. RNA 提取和反转录：操作过程及注意事项见第一讲。

2. Mix 配制：一般 Real-Time PCR MasterMix 都是 2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于Real-Time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做 3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进行统计分析。根据所用 MasterMix、模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：

• MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4 度。

• 更多的配制 Mix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。

• 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！

• 所有成分加完后，离心去除气泡。

• 每个样品至少 3 个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是 ROX。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非 PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把 ROX 配制在 MasterMix 或者 Premixture 里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加 ROX 染料校正。

通常来讲，Real-Time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80‐150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断 PCR 产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

好啦！样品上机，qPCR仪已经在努力奔跑了，数据出来后我们进入Real-Time PCR 的数据分析阶段！

相对于只能半定量的常规PCR而言，qPCR的优点是既可以用于判断序列的有

无，即定性，也可以用于确定DNA拷贝数，即定量。而且qPCR的结果无需通过电泳，而是通过计算荧光值来评估。由此可见，数据分析在qPCR这项实验中的份量。

qPCR 的数据分析可以分成相对定量和绝对定量两种。比如处理组细胞与对照组细胞相比，X 基因的mRNA 改变了多少倍，这就是相对定量；在一定数目的细胞中，X 基因的mRNA 有多少个拷贝，这就是绝对定量。通常我们在实验室用得最多的就是相对定量的方法，本讲将详细解析相对定量的数据处理。

相对定量的分析结果是在相当量的实验组和对照组中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。这种分析方法是通过等量样本间比较得到结果，需要进行归一化处理以确保相比较的两组样本具有可比性。通常我们会选择使用在各个样品中表达保持不变的基因作为参照基因（内参），用内参的表达水平来进行归一化处理。

相对定量qPCR

何时选用相对定量qPCR？

如果对 RNA 模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，可以使用相对定量法。

常用的相对定量数据分析方法有：双标曲线法、ΔCt 法、2‐ΔΔCt法(Livak法 )、用参照基因的ΔCt 法和 Pfaffl 法。

• 双标曲线法：每次实验都分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线， 并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后使用如下公式得出目的基因表达差异。

双标曲线法不受扩增效率差异的干扰。但是对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线，而且必需有固定的标准品做标准曲线。

• ΔCt 法：不用内参基因作为标准， 实验设计简单，数据分析处理简单。 需要准确量化初始材料（如细胞数目或核酸微克数），扩增效率为 100%。计算公式如下：

2^‐ΔCt=2^{‐（实验组 Ct‐对照组 Ct）}

• 2^‐ΔΔCt法：这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率都接近 100%，且相对偏差不超过 5%。计算公式如下：

首先用内参基因的 Ct 值对实验组(test)和对照组 (con)的靶基因 Ct 值进行归一化：

ΔCt test=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值

ΔCt con=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值

随后用对照组的Ct值归一实验组的ΔCt：

ΔΔCt=ΔCt test-ΔCt con

最后计算表达水平的差异倍数：

Change Fold=2^‐ΔΔCt

• 用参照基因的ΔCt 法：这个方法的使用前提与2^‐ΔΔCt法相同。计算方法如下：

对照组表达=2^{(对照组内参 Ct‐对照组目的基因 Ct)}

实验组表达=2^{(实验组内参 Ct‐实验组目的基因 Ct)}

这种方法得到的对照组表达水平不是 1.0，但如果将得到的两个表达值都除以对照组表达值，则得到：

对照组 Ratio=1

实验组 Ratio

=2^{(实验组内参 Ct‐实验组目的基因 Ct)}/ 2^{(对照组内参 Ct‐对照组目的基因 Ct)}

=2^{‐[(实验组目的基因 Ct‐实验组内参基因 Ct)‐ (对照组目的基因 Ct‐对照组内参基因 Ct)]}

=2^{‐(ΔCt test‐ΔCt con)}

=2^‐ΔΔCt

得到的比值与2^‐ΔΔCt法是相同的，因此用参照基因的ΔCt 法是2^‐ΔΔCt的一种变化形式。

• Pfaffl 法:当目的基因扩增效率(E target)和内参基因扩增效率(E ref)不同，但每个基因在实验组和对照组扩增效率相同时，可以按下列计算公式确定表达差异。

首先，与 2^‐ΔΔCt法的计算过程一样，先进行归一化校准：

ΔCt target=对照组目的基因 Ct‐实验组目的基因 Ct

ΔCt ref=对照组内参基因 Ct‐实验组内参基因 Ct

随后计算表达水平的差异倍数：

Change Fold= (E target)^{ΔCt target}/(E ref)^{ΔCt ref}

如果 E target= E ref=2，那么 Pfaffl 法就可以简化为：

Change Fold

=2^{ΔCt target}/2^{ΔCt ref}

=2^{ΔCt target‐ΔCt ref}

=2^{(对照组目的基因 Ct‐实验组目的基因 Ct)‐(对照组内参基因 Ct‐实验组内参基因 Ct)}

=2^{‐[(实验组目的基因 Ct‐实验组内参基因 Ct)‐ (对照组目的基因 Ct‐对照组内参基因 Ct)]}

=2^{‐(ΔCt test‐ΔCt con)}

=2^‐ΔΔCt

因此，事实上，2^‐ΔΔCt法是 Pfaffl 法的简单特例。

那么，这些方法我们都必须一一掌握吗？ NO！只需要掌握最实用的双标曲线法和2^‐ΔΔCt法就足够应付所有情况了。