Premier5携手oligo，共同设计PCR引物

作者：解螺旋.子非鱼

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导语

一直以来，Premier5和Oligo软件可以说是设计PCR引物的经典存在，那么有着强大引物自动搜索功能的Premier5遇到评价分析能力强悍的oligo，势必会碰撞出巨大的火花，则今天小鱼就把PCR引物设计的经典套路介绍给大家。当然，任性到连软件都不想下载的小伙伴们可回复primer，即可查看在线设计PCR引物的三种方法。

用Primer Premier 5搜索引物

1. 以小鼠的IL-17为例，进入NCBI界面,选择Nucleotide后，输入IL-17，点击search.

然后选择第三个选项——人类IL-17的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，选定目的序列。

 

2.打开Primer Premier5软件，点击菜单栏File|New|DNA Sequence，在出现的对话框里黏贴目的序列，并在paste对话框里选择As Is，点击OK。

 

3.点击Primer，弹出菜单后点击search按钮。

在弹出的Search Criteria中，选择PCR primers，Pairs 参数，并选择所需

PCR产物长度，点击OK。

在弹出的search progress菜单中，点击OK。

 

4.在搜索出的结果列表里选择Rating值高，bug较少的引物#1，在Primer Premier中选择S（正义链）/A（反义链），点击edit primer，将所得引物改成为Rating值为100，无bug的引物，即无发夹（Hairpin）、无二聚体（Dimer）、无错配（False Priming）和交叉配对（Cross Dimer）的引物。

5.点击菜单栏中Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer，即可得到设计的引物。

Sense Primer:5'  TCAGACTACCTCAGCCGTTCC  3'

Anti –sense Primer: 5'  GGTGGTCCATCTTTCCCT  3'

用Oligo验证评估引物

（回复“Oligo”，可查看用oligo软件设计引物的文章）

 

1. 打开Oligo界面如下：

   
   
   
   

单击菜单栏里File∣New Sequence可打开以下窗口。并将设计好的上游引物黏贴在空白框里。

2.点击菜单栏里Accept/Discard中的Accept，则会出现Tm、△G和Frq三个窗口, △G值反应了序列与模板的结合强度，最好引物的△G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对较低。

3.点击菜单栏里的Select中的Upper Primer将当前引物设置为上游引物。同时点击菜单栏里的Edit中的“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列。

点击Accept and Quit命令即可。

 

4.最后，在菜单栏中Analyze完成引物各种分析即可。

①Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Premier5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的△G和3’端的△G。3’端的△G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。

②Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择Upper Primer或Lower Primer引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。

 

引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计形成的引物二聚体是不稳定的，即其△G应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和△G值。

 

③Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，△G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。

 

④Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％ 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Premier5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。

 

⑤第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Premier5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给出正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。

 

⑥Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”。在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度。另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且△G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。

 

⑦引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和△G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。

 

5.引物确定后，将引物序列送至公司进行合成即可。