作者：米粒儿
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上周更新的文献精读秋季班第六讲由馒头老师主讲外泌体研究套路。选取文献来自于外周血管病1区杂志Circulation Research，2016年影响因子为13.965。
文献中文题目：CD34+干细胞来源的外泌体通过血管生成机制促进下肢缺血的修复作用。
通过题目可知，本研究的主题是干细胞来源的外泌体，外泌体通过血管生成机制造成下肢缺血。之所以选择外泌体这一主题，主要有两个原因：（1）外泌体是一个研究热点，在今年国自然中标项目中，与外泌体相关的项目已达300多项。（2）外泌体应用相对较为广泛，在治疗和诊断中都有很多文章报道。
首先介绍一下文章背景，干细胞对于组织的修复与再生主要是两方面，第一方面干细胞直接分化为血管细胞，心肌细胞等，另外一方面是旁分泌作用，可以促进血管新生，对心肌细胞有保护作用，也可以促进心肌细胞再生。最后，它还具有免疫调节作用。
10年之前，干细胞的研究热点集中在干细胞分化方向。在受损组织直接移植干细胞，并促分化新生细胞是临床关注的焦点。但近年来发现，直接的移植常常带来不可预计的负面的效应。
而近年来研究发现干细胞旁分泌物-外泌体是干细胞介导干细胞受损修复作用的主要原因。因此干细胞来源的外泌体渐渐成为干细胞组织再生和修复作用领域研究的新热点。既然说到了外泌体，下边我们来介绍一下外泌体。
作者早在2011年已经报道了CD34+干细胞来源外泌体与血管新生间的关系，我们先看一下这篇报道里作者关于CD34+来源的外泌体的描述。下图是电镜下外泌体形态，外泌体具有双层膜结构，粒径分布在80nm左右。
下图是外泌体的生物学，用western blot和流式检测CD34,CD63和AnnexinV，TSG101外泌体标注物，都呈现阳性表达。
此外，这篇文章通过体外和体内实验对CD34Exo对脐静脉内皮细胞成管、活率及增殖功能的影响。
以上介绍的是作者自己课题组的前期工作，那么该领域其他的研究进展怎样呢？关于外泌体，我们目前已知外泌体中含有蛋白，miRNA等，不同的细胞及细胞外环境会影响外泌体的内容物。且内容物中既含有有益物质也含有有害物质。而对于外泌体是否有利于干细胞治疗以及它的作用机制，是需要进一步研究的。
本文基于前期研究结果，提出科学假说CD34Exo促进血管新生，并通过下肢缺血模型验证表型，高通量芯片筛选靶点，体内体外实验验证功能，确定作用机制。最终证实科学假说。
结果总览
本文共有7张图，可分为3部分。
图1和图2是文章的第一部分：体内现象观察。发现CD34Exo改善下肢缺血模型小鼠的血管再生和功能。
图3是高通量测序结果，进行机制探索，确定作用靶点MiR-126。
而图4-7是文章的主体部分，体内和体外功能实验验证高通量测序结果。
数据解构
图A动物表型的现象观察，图B是激光多普勒血流成像结果。从这两个结果上看，CD34Exo改善下肢缺血模型小鼠的血管再生。
而图c-e中，分别发现CD34Exo，CD34-CM和CD34+ Cells明显改善坏死、再灌注、下肢运动功能和保肢评分。
图2是在组织水平的检测结果，在小鼠处死前采用BS-1植物凝集素注射，处死后对下肢组织包埋、切片。并采用抗植物凝集素一抗体和荧光二抗进行检测。发现CD34+ Cells，CD34Exo，CD34-CM明显改善下肢组织的毛细血管密度。
图1和图2分别在动物和组织水平发现CD34来源的外泌体可以促进血管新生。而接下来图3试图找出该现象的作用机制，作者选择高通量的方法。通过蛋白和miRNA芯片检测作用靶点。
作者采用与血管生成相关的蛋白array，检测各蛋白的表达情况。发现CD34+Exo组并没有显著的蛋白富集。说明促血管新生现象不是通过调控蛋白表达的机制实现的。
接下来又对miRNA进行芯片检测。发现无论是CD34+Cell还是CD34Exo中miR-126都呈现高表达，因此miR-126被选为研究靶点。
图4是体内/体外验证敲减miR-126 CD34Exo丧失血管生成功能。
其中图A是在细胞中检测miR-126表达，发现EXO内miR-126表达显著高于细胞。而敲减CD34+细胞中的miR-126后，植物凝集素染色毛细血管长度显著降低。
体内功能实验也发现，miR-126敲减后，下肢缺血没有得到显著性改善。
而在下肢运动功能和血管生成等分析，也可以发现miR-126是CD34Exo发挥作用的主要靶点，敲低miR-126 CD34Exo将丧失促进血管再生的能力。
图5-图7是的实验是本文能发在10分以上的重要原因。我们先看图5，图5作者主要回答的是miR-126表达升高，是CD34+外泌体促进血管生成的原因还是结果呢？首先作者对miR-126和pri-miR-126进行检测，为什么选择这两个指标呢？
我们知道当我们向小鼠体内注射CD34Exo后， 小鼠体内的miR-126表达可能是注射的CD34Exo产生的也可能是小鼠体内合成的，而pri-miR-126的产生仅可能来源与小鼠体内合成。结果显示，移植外泌体后，没有引起体内miR-126的合成。也就是说miR-126升高是血管生成的因而不是果。
那么，miR-126的靶点是什么呢？SPRED1是血管生成的负向调节因子。敲低miR-126后通过上调SPRED1，使得血管生成基因VEGF、 ANG1、 MMP9表达降低。
下边作者主要是探讨miR-126能否被CD34Exo摄取并传递至内皮细胞。
在图ABC采用的主要方法是Cy3标记miRNA，检测指标包括FCM检测Cy3+细胞，confocal检测脐静脉内皮细胞摄取CD34Exo。发现外泌体能够摄入Cy3-miRNA，并将其传递给内皮细胞。
下边是体内实验，采用方法是R-PE标记CD34细胞。检测指标包括FCM检测R-PE+细胞，congocal检测细胞摄取CD34Exo。分析结果显示内皮细胞可以特意向吞食外泌体。
Confocal image结果显示下肢缺血组织摄取R-PE-CD34Exo（Figure 7）。
那么内皮细胞特意向吞食外泌体后，发生了什么变化呢？图B FCM显示CD31+内皮细胞前向、侧向角改变，提示细胞周期改变。
qRT-PCR检测下肢缺血组织细胞周期蛋白表达也证实了以上结果。
套路解析
在数据解析之后，馒头老师为大家总结了本文的中用到的主要研究思路和方法。
第一步是外泌体的分离和鉴定。外泌体分离方法，通常采用的方式是超离。当然SBI试剂盒也是不错的选择。而在外泌体鉴定方面通常采用电镜检测形态，WB和FCM测定表面标志物。标记一般采用荧光染料。
第二部对外泌体靶标的筛选方法，和一般的靶点筛选方法大致相同，通过芯片方式结合生物信息学方法进行差异分析，靶基因预测。最后通过qRT-PCR实验验证。
第三部功能验证，对于下游功能验证中主要采用gain of function和loss of function方法。
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