17分期刊上对阿兹海默的新思考

解螺旋公众号·陪伴你科研的第1969天

Aβ和tau蛋白的生理活性不随年龄增长而增强

阿兹海默病（AD）是最常见的老年病。β-淀粉样蛋白（Aβ蛋白）和tau蛋白折叠聚合成的神经纤维缠结 (neurofibrillary tangles ，NFTs)是AD的发病原因。朊病毒样蛋白（PrPSc）是一种由宿主基因编码，可自我繁殖蔓延，具有异构体的蛋白质。

在Science Translational Medicine 上有篇题为“Aβ and tau prion-like activities decline with longevity in the Alzheimer's disease human brain”的研究，作者认为Aβ蛋白和tau蛋白病理性异构体在大脑中散布的行为类似，由此作者将二者做了类比。

目前有许多关于Aβ作用的假说，例如Aβ蛋白的沉积不是导致AD发病的必要条件，或Aβ蛋白仅暂时性引发tau蛋白错误折叠或与其他聚合成NFTs。由于Aβ蛋白低聚物的积累，Aβ也许会表现出短暂的毒性，通常在AD发病初期达到峰值，即AD病程中的前驱阶段。

此外，已有研究报道了Aβ蛋白的寡聚化、沉积和扩散的早期稳定进展。为了证明AD严重性的增加与Aβ在脑中的分布扩散以及在脑脊液（CSF）中含量的降低有相关性，作者希望在AD患者的大脑组织（剖检所得）中快速测定和比较Aβ蛋白和tau蛋白活性。

目前测定病理性Aβ异构体的方法包括转基因小鼠模型或者体外超生理肽浓度的生理性测试。已有研究证明，将AD患者的脑源性Aβ蛋白以及人工合成Aβ转入小鼠中，均可导致小鼠产生朊病毒样蛋白行为。然而目前的临床成像配体技术仅测定不溶性淀粉样蛋白，但该蛋白在疾病中的作用尚不明确。

但上述成像方法无法测定具有生物活性的神经侵袭性朊蛋白样Aβ蛋白和tau蛋白。因此本文作者建立了一种灵敏的细胞定量实验，用于测定脑组织中神经侵袭性Aβ蛋白和tau蛋白的生理活性。

结果：朊病毒样Aβ蛋白和tau蛋白的活性随着年龄增加而降低，且tau蛋白活性降低与tau蛋白磷酸化水平同步减少。所以，在较年轻的死亡患者大脑中，总不溶性tau蛋白的丰度是最低的，但tau蛋白活性却相对较高。

结论：朊病毒样Aβ蛋白、tau蛋白的生理活性及其磷酸化水平随年龄增大而降低，内在不溶性tau蛋白的总含量并不与寿命相关。

测定方法

1）合成Aβ-黄色荧光蛋白（YFP）和tau-黄色荧光蛋白（YFP）融合蛋白；

2）合成Aβ蛋白纤维，同时提取大脑组织中Aβ蛋白和tau蛋白；

3）使用HEK293T细胞构建表达YFP-Aβ融合蛋白的稳转株，使得细胞质均匀表达低水平黄色荧光 (Fig.1)；

4）脂质体转染Aβ蛋白合成纤维或大脑组织Aβ蛋白和tau蛋白进入细胞，这些可自我增殖且错误折叠的蛋白可以诱导细胞中YFP-Aβ蛋白融合蛋白的错误折叠和聚集，该过程类似于患者脑中的病理过程。(Fig.2)；

5）通过共聚焦显微镜观察荧光点数量，并以此表示阳性细胞比例，作者定义该比例为f(Aβ)，代表蛋白的活性强度。

Figure.1 稳转细胞质中均匀分布淡黄荧光，朊病毒样Aβ蛋白转染后出现强黄色荧光斑块

Figure.2 稳定表达YFP-Aβ的HEK293T细胞经过脂质体转染朊病毒样Aβ蛋白纤维

结果分析

1. 亚型特异性和序列特异性Aβ蛋白细胞实验

建立融合构建体检测细胞系

Aβ40和Aβ42合成纤维都可以剂量依赖方式诱导YFP-Aβ42细胞系中的聚集，且N端构建具有最好的聚集效率，即YFP-Aβ42，但YFP-Aβ40细胞系只受Aβ40合成纤维的调控，具有亚型特异性。因此，YFP-Aβ42细胞系更适用于测定外源性Aβ纤维诱导后朊蛋白样Aβ蛋白的活性。

稳转细胞对脑源性分泌蛋白的检测特异性

作者使用了两种转基因小鼠，分别是TgAPP23和TgCRND8小鼠，二者属于自发积累Aβ的淀粉样蛋白前体（APP）转基因小鼠。细胞实验显示分别用相应的蛋白进行刺激，对应的稳转细胞系才可观察到蛋白的朊病毒样活性，证明了该细胞检测方法的灵敏度较高（Figure 3）。

在动物实验中，在200-300天即可检测到TgAPP23小鼠脑中朊病毒样Aβ蛋白活性的时间，与TgAPP23小鼠脑中首先发生淀粉样蛋白斑和神经胶质细胞增多的时间一致。而且，随着年龄增加，可检测的淀粉样斑块越多，意味着Aβ蛋白活性持续增强。这一发展趋势在TgCRND8转基因小鼠中也可观察到。

Figure.3 用小鼠脑源性Aβ蛋白、tau蛋白和α-突触核蛋白分别刺激相应的HEK294T细胞

2. 人源脑组织tau蛋白和Aβ蛋白检测

①Aβ蛋白和tau蛋白在患者死亡后仍然有活性，且在部分疾病中两者具有线性关系。作者收集了患有不同神经退化性疾病的患者剖检所得大脑匀浆，包括tau蛋白病进行性核上性麻痹（PSP）和基底节变形（CBD），Aβ蛋白病大脑淀粉样血管病（CAA），Aβ和tau均有的AD，α-突触核蛋白病多系统萎缩（MSA），分别检测大脑组织中Aβ蛋白，tau蛋白和α-突触核蛋白的含量。

结果表明，在所有的AD和CAA脑组织中都能够检测到朊病毒样Aβ蛋白的活性，表明在患者死亡后Aβ蛋白的活性依然很强且能够在冰冻条件下保存。此外，仅在MSA患者脑组织中检测到α-突触核蛋白的活性，在PSP和CBD患者脑组织中仅能检测到tau蛋白活性，这些结果与该疾病的致病原一致。

②Aβ蛋白和tau蛋白在不同表型的AD中与寿命呈负相关(Fig.4)。作者分别检测PSEN突变、APP突变的家族性AD和散发性AD病例中朊病毒样Aβ蛋白和tau蛋白的活性。

结果显示Aβ蛋白和tau蛋白活性与寿命呈负相关，与性别和疾病表型均无关联，意味着患病者年龄越大，其大脑中Aβ蛋白和tau蛋白的活性越低。然而这一结果与小鼠实验相矛盾，因此作者用Elisa实验做了进一步的验证。

Figure.4：AD病例中朊病毒样Aβ蛋白和tau蛋白活性与寿命呈负相关

3. Elisa检测APP、Aβ蛋白和tau的表达水平

Figure.5 Elisa方法检测不同构型的Aβ蛋白和tau蛋白浓度与年龄的相关性

4. 归一化计算tau蛋白丰度

Figure.6：朊病毒样tau蛋白和p-tau蛋白的归一化

Figure.7：朊病毒样tau蛋白和p-tau蛋白的半衰期

讨论

（1）本文作者建立了一种灵敏的细胞定量测定实验，用以测定大脑中Aβ蛋白和tau蛋白的活性，并通过动物组织，人脑组织进一步展示和完善该测定方法的灵敏度。

（2）同时，本文测定结果与目前对AD和tau蛋白的认知相差甚远。以往的研究认为NFTs的丰度与AD发展过程中大脑萎缩和认知下降的程度相关，但是这些研究仅关注总体不可溶性tau蛋白。

作者收集了各年龄段的患者样本，发现Aβ蛋白和tau蛋白的活性都与年龄呈负相关，虽然在本实验中Elisa方法检测到不可溶性tau蛋白浓度与年龄呈正相关，但是经过数据归一化处理后，不可溶性tau蛋白的磷酸化程度和活性却是与年龄呈负相关。

因此作者认为tau蛋白活性降低与tau蛋白磷酸化减少是同步的，与寿命相关，但无法说明不可溶性蛋白浓度与寿命相关。

（3）此外，作者没有讨论与临床实验结果相矛盾的动物实验结果，尽管该动物实验是用于检测该细胞检测方法的特异性，但动物实验关于tau蛋白的变化和磷酸化程度仍然可以做进一步检测和验证。

—END—

相关文章

Nature背靠背重磅发文，基金高达6000万，这个领域真的很火爆

从Cell上的乳腺癌研究中，我们能学到哪些套路

同样是疲于奔命的医生，为何他不做实验半年就能发表16篇SCI

《科研逻辑方法论》训练营限时开启报名啦

本训练营用诙谐风趣、通俗易懂的语言，带你开启基础科研知识体系的大门，

跨越3分水平，掌握科研逻辑方法论

点下“在看”，多根头发