老司机带你解锁ImageJ划痕实验宽度分析

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一种新颖、准确高效的ImageJ划痕宽度分析方法！

伤口愈合实验（Wound healing assay）是一种操作简单、经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法，在SCI论文中得到了广泛的使用【1】。

如何分析划痕实验结果却令很多人头疼！

划痕实验常见的统计指标是统计伤口愈合百分比（Wound healing percentage）和划痕宽度。

伤口愈合百分比本质上是一种面积分析，半夏在往期已经给大家分享过30秒搞定划痕面积分析，有兴趣的童鞋可以自行查看！

划痕面积的基本分析步骤为：

对划痕图片进行Process -> Smooth平滑后进行Process -> Find Edges寻找边缘，再使用Image -> Adjust -> Threshold，阈值选定后进行划痕面积分析：

划痕面积的分析相信大家已经很熟悉了，然而使用ImageJ分析实验划痕宽度却困难重重！在网络上我注意到有很多人都对划痕宽度计算心存疑惑：

关于宽度计算目前常用的方法是使用Plugins -> Analyze -> Grid添加等距的水平线（Horizontal lines）或是垂线，再沿着水平线或是垂直线手动画出划痕宽度，再使用Analyze -> Measure进行计算：

这种方法存在缺点：

手动画线起点和终点欠精确；
添加的等距水平线数量有限，得到的平均宽度不准确；
工作量大，浪费时间。

基础知识准备

(1)灰度值

灰度值纯黑为0、纯白为255：

（2）Plot Profile

Plot Profile（快捷键 Ctrl+K）见于Analyze -> Plot Profile，适用于线和矩形选框，表示线段和矩形选框所经过的范围内的灰度变化（荧光强度），如下图：

Plot Profile常用于定性表示荧光共定位【2】与矩形范围内荧光强度变化【3】：

划痕宽度分析

（1）划痕面积分析

1. ImageJ打开待分析划痕图片，先通过Image -> Type -> 8-bit将图片格式转化为8-bit灰度图片，再通过Process -> Smooth将图片进行平滑处理，最后点击Process -> Find Edges寻找边缘：

2. Process -> Filters -> Gaussian Blur…Sigma设为6，对图片进行模糊处理：

3. Image -> Adjust -> Threshold，按照自己需要调整适合的阈值，调整合适后点击Apply：

此时得到的图片黑色灰度值为0，白色灰度值为255。

4. 使用魔棒工具选择划痕，Edit -> Clear清除划痕内部的细胞，然后使用Edit -> Clear outside去除非划痕部分的白色空隙。Edit -> Invert将划痕转变为灰色，再次对整张图片进行反转，得到划痕为白色、非划痕部分为黑色：

5. 验证所得划痕面积的准确性

利用魔术棒点击白色区域，点击Analyze -> Tools -> ROI Manager…-> Add，打开原图片，点击ROI Manager中刚刚Add的区域，此区域将会显示在原图片中，通过符合程度返回第3步调整阈值，调整目的区域：

（2）划痕宽度计算

1. 将得到上步骤得到黑白划痕图片使用Image -> Transform -> Rotate 90 Degrees Right/Left进行旋转：

2. Edit -> Selection -> Select All全选整个图片。点击Analyze -> Plot Profile，再点击结果左下角的List，点击新弹出窗口中Edit -> Copy，复制所有数据，粘贴至新建Excel中：

3. 划痕宽度分析思路

Plot Profile得到的Gray value变化是整张图片从左往右对应的每个高度的灰度值的平均值。黑色灰度值为0，白色灰度值（代表划痕）为255，仅有白色范围可以影响平均灰度值。

示例划痕图片长宽为460*500 pixels，则有460条竖直线覆盖图片，下图X为竖直线编号。划痕宽度乘以255除以500即对应平均灰度值。反之利用利用公式：(Y*500)/255就可以得到整条线上白色的区域的长度（500为一条线的总长度），也就是划痕宽度：

进一步可以求每张划痕的平均宽度。值得注意的是，本次计算划痕宽度没有进行标尺校正操作，故得到的宽度单位为像素。

在Analyze -> Set Scale进行标尺校正后可以得到其实际距离。

最后，检查一下所求宽度是否和实际相符：

总结

利用对二值化图片进行Plot Profile操作，我们便捷、准确的获取了划痕对应的每一个像素的宽度，这提示我们在日常的科研生活中应该勤于思考、做到举一反三！今天的给大家分享ImageJ高效分析划痕宽度就到此为止了，希望对大家有所帮助！

参考文献：

1. Wei Y, Gong J, Xu Z, et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(50):E6927–E6936.

2. Nuclear DNA helicase II is recruited to IFN-alpha-activated transcription sites at PML nuclear bodies. Fuchsová B, Novák P, Kafková J, Hozák P - J.Cell Biol. (2002).

3. Sorting of Dendritic and Axonal Vesicles at the Pre-axonal Exclusion Zone. Cell Rep. 2015Nov 10;13(6):1221-1232. doi: 10.1016/j.celrep.2015.09.074

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