解螺旋公众号·陪伴你科研的第2520天
今天为大家带来一篇影响因子高达8.9分的一篇分析基因家族的生信文章，影响因子虽高，但复现难度却不大，借鉴意义非常大，性价比如此高的文章，各位看官心动不如行动，一起跟着我复现吧！ 本文宏观分析了E2F基因家族,为什么作者注意到这个基因家族了呢？前期的研究证明E2F家族成员在哺乳动物的细胞周期调节和DNA合成中起主要作用，且有很多文章证明了E2F在许多恶性肿瘤中（膀胱癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌等）有表达升高现象。 但是目前没有文章研究关于E2F在乳腺癌中的生信分析，所以作者就做了以下分析，我们都知道，基础科研往往只能聚焦一个小点，进行深挖机制，而生信研究却可以多基因，多维度进行分析，因此这也是生信研究的特色，是一个很适合临床医生搞的科研方向。 本篇文章共有9张大图一张表，可以看出来本文数据量还是非常扎实的，俗话说得好：逻辑不难，就得拿数据来凑。话不多说，且往下看。 Result2：E2F基因水平与乳腺癌患者临床病理参数的关系 Result4：对乳腺癌患者的E2Fs因子及其邻近基因的功能富集分析 （https://www.xiantao.love/products） （http://www.oncomine.org） (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)
(http://gepia.cancer-pku.cn/)
（https://www.proteinatlas.org/） ◆ cBioportal数据库 （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/） （https://www.genome.jp/kegg/） 现在一切准备就绪，没时间解释了，快上车！跟着我一起开始复现之旅吧！ 在哺乳动物细胞中已经鉴定出八种E2F因子，作者利用oncomine数据库比较了这8种基因在癌和癌旁表达的差异 登陆oncomine数据库 （https://www.oncomine.org/resource/main.html） 首先，在【search】这一栏输入E2F1，就会在右边展示E2F1在各个癌种中的表达情况，按照同样的步骤，将E2F2-8分别做出来，拼接到一起，即可得到figure 1。 在这里，可能不少小伙伴有些疑惑，全靠截图软件拼起来的图片，分辨率能达到杂志要求吗？众所周知，杂志影响因子越高，对图片的质量要求越高。那如何尽可能得到高分辨率的图片呢？在这里，我给大家介绍一个小神器~ 不知道各位宝宝们是不是一想到截图，第一反应就是用QQ或者微信截图，虽然是傻瓜式操作，但是功能却很局限，在这里我要跟大家介绍的也是一款截图神器，但是却是可以拿来做科研的截图神器~ 当我们在oncomine界面上得到E2F1在各个癌种上的表达后，我们可以自己在EXCEL新建一张表，颜色自己填进去，另存为PDF后，放在拼图软件里就是一张矢量图，无论怎么放大，都不会失真，说到这里，不少小伙伴肯定有些疑问我要怎么才把颜色填进去呢？这里我们就要用到了snipaste神器。 1：在搜索引擎中搜索“snipaste下载“即可找到下载链接，按照提示一步步安装即可 这个截图软件功能很多，比如说可以方便标注图像（可以利用矩形，椭圆，箭头，马赛克，文字等标注），在这里我们用到的是snipaste的取色功能。 第一步：按下F1（安装时默认是F1进行截屏）之后，把光标放在需要取色的框框中，下方就会出现RGB的3种颜色，我们在这里用E2F1在Bladder Cancer中做一个示例，如图所示，显示RGB的3种颜色分别为255，0，0。 第二步：我们在EXCEL画好框架后就可以进行填色，具体步骤如下图所示。 把光标放在需要填色的格子里，点击填充颜色--其他颜色 点击【自定义】，将RGB颜色填我们上一步取色到的数值，点击【确定】 这样第一个格子就填好颜色，同样的步骤做完，就可以得到一张无论放大多少倍都不会糊的高清原图啦 那研究基因家族在各个癌种中的表达是不是还有别的方法呢？ 答案当然是Yes，我们的仙桃工具可以一键出（泛癌）图 生信高级版选择【表达差异】
【非配对样本】
癌种选择泛癌
分子输入E2F1
点击【确认】，同样的，将E2F2-8用同样的方法拼接起来，即可得到Figure 1
接着我们来看一下Table1是如何利用oncomine数据库做出来的，我们这里依然用E2F1做一个演示。 首先，点击【Analysis Type】--【cancer vs. Normal Analysis】--【Breast Cancer vs. Normal Analysis】就可以看到E2F1在乳腺癌中有14个数据集，从下图数字4标的框框中，我们就可以看到Table1列出的来自于TCGA中E2F1表达倍数分别为2.734，3.216，2.088。和我们复现时的数据一模一样。 Table1还列出了除fold change以外更具体的信息，那我们可以点击进入Gluck Breast数据集中，这样我们除了知道fold change为2.545以外，右边还有更加具体的信息，比如说p-value为2.29E-5，t-test为10.681。同样的步骤做完，就可复现得到和Table 1完全一致的图。 本张图由GEPIA在线数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）得到，我们一步一步来复现： 打开GEPIA网址，在【enter gene name】输入E2F1， 点击【Expression DIY】选择【Profile】 E2F1在乳腺癌中的表达图可直接下载，同样的步骤将E2F2-8表达图画出来拼接到一起即可得到Fig 2A 点击【Expression DIY】选择【Boxplot】 图形显示出来，点击右上角的下载按钮，同样的步骤将剩下的E2F2-8补齐，即可得到Fig 2B。 关于Fig 2我们还可以利用解螺旋的生信工具来复现，图更精致，美观。 点击确认，这样E2F1在乳腺癌中mRNA表达水平就表示好了，同样的步骤，将E2F2-8都画出来，拼接好，即Fig2B。 E2F1和E2F3组差异显著，而E2F2，E2F4，E2F5，E2F6，E2F7，E2F8组的差异都不显著。 点击【Expression DIY】选择【Stage plot】 【plot color】这里可以任意选成自己喜欢的颜色，文中作者选了红色，这里我们也选择红色 点击下载按钮，同样的步骤将E2F2-8分析出来，拼接到一起即可得Figure 3 利用IHC（免疫组化）检测E2Fs蛋白在乳腺癌组织中的表达
结果显示，E2F1，E2F2，E2F3，E2F5，E2F7，E2F8蛋白的表达在乳腺癌中比在正常组织中有更高的表达。 由于作者这里是自己的抗体做的免疫组化结果，是实验操作，我们这里用HPA数据库来复现本张图。 我们来简单介绍一下HPA数据库（https://www.proteinatlas.org/），目前收录了超过26000种抗体，所有结果均有免疫组化染色，并且经过专业人员确认，准确度很高，可信度强，最重要的是免费，所以在这里我有一个建议给大家，在大家买抗体做免疫组化之前，不妨进这个网站先来看一下蛋白表达情况，让自己心里有个数~ 在这里我们依然以E2F1为例，输入基因【E2F1】 会出现非常多已经染好的免疫组化片子，这个软件的优点也在于染出来的片子会配备很详细的病人信息，比如说年龄，染色的深浅程度，染色位置位于胞浆还是核，抗体信息等。 同样的步骤将E2F2-8图拼接起来即可得到Figure 4 证明了E2F1，2，3，5，7，8高表达，E2F4,6低表达和乳腺癌患者的预有关系
（ http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background），这个数据库是一个生存分析的在线工具，最初是设计用来对肝癌中的miRNA进行生存分析，后来在此基础上进一步拓展，目前支持21种肿瘤类型，包括miRNA和mRNA的生存分析，用法很简单，我们这里还用E2F1举例，复现步骤具体如下： 点击首页【breast cancer】进入分析页面 【use multiple genes】这里可以输入多个基因，批量进行生存分析，这个功能非常适合本篇文章，对E2F基因家族进行分析，这里先用E2F举例。 这里【split patients by median】可以根据基因表达量将样本分为高低两组，这里支持按照均值等多种统计量来分类，这里我们选择median分析。 KM-plotter支持多种事件的生存分析，对应不同类型 RFS（relapse free survival）以复发作为生存分析中的事件，用来分析手术治疗的效果 OS（Overall survival）分析从确诊之后患者的生存时间 DMFS（Distant Metastasis Free survival）将肿瘤的转移作为生存分析中的事件 PPS(post progression survival)主要分析预后的生存情况。 这里可以个性化筛选，根据自己的需求筛选临床信息，这一步，我们本次复现不需要选 确定之后，点击【Draw Kaplan-Meier plot】可以直接出图。 按照同样的步骤，一步一步下载，拼接图片，即可得到Figure5。 进入高级版仙桃工具，选择【预后分析】--【KM曲线图】 点击确认，这里和文章中数据不太一致，生信工具里收录的数据更全更新一点，在这里，KM-Plotter结果和生信工具结果如何取舍的话，我建议以生信工具为准。 对乳腺癌患者的E2Fs因子及其邻近基因的功能富集分析
本张图用到了cBioportal分析工具（https://www.cbioportal.org/）我们来简单介绍一下这个数据库，它是探索肿瘤的基因组学特征的一个数据库，是从DNA水平进行的，是对机制的进一步研究，本数据库不用注册，可免费使用。这个网站目前存储DNA拷贝数数据，mRNA，miRNA的表达数据，非同义突变，蛋白质水平和磷蛋白水平数据，DNA甲基化数据和一些有限的临床数据等。 进入cBioportal，选择Breast数据集，文章中说选择了1105的数据集，但是目前从cBioportal收录的乳腺癌中只有这个Breast Invasive Carcinoma(TCGA,PanCancer Atlas)包含1084个样本复现出的结果和文章最相似，所以我们就用这个数据集进行复现。 这一步根据需要要不要选mRNA Expression，这里我们主要想看突变情况，所以勾选了前两栏 即可得到E2F家族在乳腺癌中的突变频率，即Fig 6A1 点击【OncoPrint】列出E2F基因家族的突变频率，即Fig 6A2 Fig 6B 作者通过RNA-seq version(v.)2 RSEM包括了Pearson校正来分析E2Fs家族的相关性。 E2F1与E2F2/E2F4/E2F7/E2F8之间存在显著正相关性。 E2F2和E2F1/E2F7E2F8存在显著正相关性。 E2F7和E2F1/E2F2/E2F3/E2F8存在显著正相关性 E2F8和E2F1，E2F2，E2F7存在显著正相关性 E2F1蓝色代表着分析的正是E2F1和其他基因的相关性 同样的步骤可以得出E2F1与E2F3-8的相关性分别为0.27，0.31，0.25，0.24，0.43，0.41，我们可以利用得到的这些数字，用EXCEL画出如Fig 6B的热图。 Fig 6C是通过cBioportal构建了和E2F家族相关性最强的50个基因，cBioportal这个功能在更新之后已经没有了，但是我们依然可以有很多办法可以得到和E2F家族相关性排名在前50的基因。 思路一：依然用cBioportal，我们利用共表达模块，对于E2F1我们取前100个相关性最强的基因，同样地，我们对于E2F2-8也取前100个相关性最强的基因，800个基因去交集，然后利用我们解螺旋非常牛的生信工具功能聚类模块做GO和KEGG分析。 得到相关性排名前100的基因，同样的方法得到E2F2-8相关性前100的基因，取交集。 然后我们可以在历史记录里找到【单基因相关性分析】我这里下载的是EXCEL表格，同样的操作，将E2F2-8的表格都下载完成 虽然和文章给出的图有些不一致，但是掌握方法设计自己的文章思路才是最重要的，上面列出的3种通过目标基因找与之有相关性基因的方法，如果大家合理掌握，想要设计自己的生信文章，我相信也会游刃有余。 我们推荐先点击【保存结果】，然后下载word三线表，结果如下图所示，这样的表格可以直接放在文章当中，但是如果我们想以图形展示的话，就再进行可视化 接着这一步进行可视化操作，依然是【功能聚类（圈）】，下一步选GO/KEGG可视化 将可视化的图形保存，可直接用在文章里。即得到Figure7和Figure8两张图（作者在这里可能是为了凑图，将GO和KEGG分成两张Figure，其实完全可以放在一张图上展示，这里就看各位的心情了） Figure 9A和9B列举了参与cell cycle通路和TGF-BETA signaling pathway通路部分基因，参与了乳腺癌的发生和发病机制。 1. 本图是利用KEGG在线软件（https://www.genome.jp/kegg/） 我们简单介绍一下KEGG：它的全称是Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（京都基因与基因组百科全书），它拥有多个子数据库，包含基因组，生化反应，生化物质，疾病与药物，以及最常见的PATHWAY通路信息。在搜索框里输入基因名 2. 在【KEGG GENES】模块下选择第一个通路（hsa1869）点进去 3. 选择【cell cycle】这个通路，我们可以惊喜的发现，这张图和作者的Fig 9A一模一样。 说到这里，小编有两句话想说，复现文章作者的数据不是目的，大家通过复现文章，了解这个方法之后，学以致用找到适合自己文章的通路，可以说成逻辑通顺，故事完整的文章才是我们的目的。 至此，本篇文章就复现完成了，有问题的小伙伴欢迎来找我讨论哦。
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