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注：今天是2021年高考的第一天，解螺旋在此祝所有考生高考顺利。话归正题，肿瘤转移，虽然在传播中的热度不如几年前了，但最近两年国自然都资助了超过2亿元基金，依然是实际上的香饽饽。关于肿瘤转移，我们之前也有在《肿瘤转移的百般花样儿，都逃不过这篇顶刊重磅综述的火眼金睛》推送中用万余字的长文翻译介绍了关于肿瘤转移的综述。
5月5日圣路易斯华盛顿大学内科学系的Christopher A. Maher教授在大名鼎鼎的Nature Reviews Cancer（影响因子=53.030）杂志上发表了题为《Long noncoding RNAs in cancer metastasis》的综述，系统性地介绍了lncRNA在肿瘤转移方面的研究进展。
为了帮助大家更好的吸收综述的内容，榨干其每一滴精华，本工在阅读综述的时候，也给大家翻译了遍，希望能给大家带来有真正价值的“学术营养”。
肿瘤转移是导致癌症相关死亡的主要因素。它的特点是通过获得分子和表型变化发生的多步骤过程，使原发肿瘤的癌细胞能够在远处器官传播和定植。在过去的十年中，长链非编码RNA（lncRNA）的发现和表征揭示了其调控作用的多样性，包括在整个转移级联反应中的关键作用。
在本文中，我们回顾了lncRNAs如何通过在不连续的前转移步骤中发挥作用（包括上皮-间质转化、侵袭和迁移以及有机营养定植），以及通过影响转移性肿瘤微环境促进转移（通常通过在核糖核蛋白复合物内相互作用或直接与其他核酸相互作用）。我们讨论了具有体内表型且被充分表征的lncRNA，并强调了机制上的共性，例如会趋向于（convergence）TGFβ-ZEB1/ZEB2轴或NF-κB通路，以及具有争议机制的lncRNA和方法学对机制解释的影响。
此外，一些lncRNA可以帮助识别有高转移风险的肿瘤并带动新治疗策略的开发，其中一些lncRNA已显示出作为动物模型中反义寡核苷酸治疗新靶点的潜力。除了讨论那些已被良好表征的lncRNA在转移中的作用，我们还讨论了lncRNA生物学中存在的争议和挑战。最后，我们为这个快速发展的研究领域提出了未来的研究方向。
转移性疾病是绝大多数癌症相关死亡的原因。尽管在癌症的诊断和治疗方面取得了巨大进展，但转移性癌症患者的预后仍然很差，某些癌症患者的中位生存期以月为单位。肿瘤细胞从原发肿瘤向远处器官的传播是个有序、多步骤的过程，称为侵袭—转移级联。首先，原发肿瘤细胞必须局部地侵入周围正常组织。然后，这些细胞通过血管进入体循环，随后在远处渗出，在那里发生转移的细胞需要增殖并定植在一个对细胞来说通常是外来的（foreign）组织环境。长链非编码RNA（lncRNA）被定义为长度超过200个核苷酸的RNA转录本，且没有证据表明它们可以编码多肽（图1）。虽然最开始时lncRNA仅被描述为基因间转录本，但lncRNA现在包含了天然反义转录本、重叠转录本和内含子转录本等等，这取决于lncRNA与附近蛋白编码基因的基因组排列顺序。通过高通量RNA测序已鉴定出数以万计的lncRNA，但其中只有一小部分具有功能特征。通过对肿瘤标本的差异表达分析和比较转录组学研究，各种lncRNA被优先用于功能研究，揭示了不同的表型和机制（图1）。LncRNA在基因调控中起重要作用，包括调控基因激活和沉默、X染色体失活、选择性剪接和转录后调控等。LncRNA通过各种不同的机制来实现这些功能，包括充当分子支架（scaffolds），引导染色质修饰酶，就像HOTAIR或DLX6AS一样，充当竞争性内源性 RNA（ceRNA），也可以“吸附（sponge）”microRNA或蛋白质，促进或抑制长程（long-range）染色质相互作用（例如，LUNAR1或CCAT1），甚至可通过转录过程的本身来起作用（图1）。其他的分子机制也正在涌现，例如核结构的协调（orchestration）、环状lncRNA的形成以及引起与其相互作用的mRNA的不稳定。这些和lncRNA功能相关的其他机制已经在其他地方进行了综述，并有望发现更多的机制。值得注意的是，某些机制，如ceRNA的机制模型已经引起了质疑（Box1），主要是由于靶标mRNA与其在ceRNA上的假定结合位点之间存在化学计量不平衡，而且一些lncRNA存在有多种作用机制，这也导致这个快速进化领域变得更加复杂。
LncRNA已经成为癌症通路的关键调控因子，也可作为疾病的生物标志物。最初，lncRNA仅仅是分子生物学的一个特征，而现在已发现其与大多数癌症标志都有着密切关系—如持续增殖、增殖永生、逃避生长抑制因子、诱导血管生成、抵抗细胞死亡及发生转移（图1）。
重要的是，就像蛋白编码基因一样，遗传变异是肿瘤发生的基础，lncRNA也会在恶性肿瘤中发生扩增、删失或突变。很多lncRNA位于肿瘤基因组中重复发生拷贝数变异的区域，其中包括FAL1，其基因组的扩增可抑制生长抑制基因CDKN1A。PVT1在许多癌症中也经常发生扩增，在乳腺癌和其他肿瘤的启动子区也发现了高频（recurrent）突变。
尽管这些lncRNA存在激活或缺失的潜在遗传机制而对研究人员来说变得有吸引力，但重要的是评估lncRNA基因是否位于并不常见的缺失或扩增区域内，从而表明发生遗传变异是选择性压力的结果。lncRNA的表观遗传改变也发生在癌症中，CpG岛甲基化表型中的CCAT1活化就是如此。因此，lncRNA 中的遗传和表观遗传改变可能是早期癌症基因组研究中驱动突变要明显罕见得多的原因，因为这些研究侧重于蛋白编码基因。
与蛋白编码基因相比，它们的假定结构域提供了对其功能的理解（并且可以被破坏），lncRNA的调控机制是多样的，而且仍在不断出现。值得注意的是，PVT1作为DNA调控元件（即顺式作用机制）和RNA转录本（即反式作用机制）都具有重要的功能。这个概念并不是PVT1独有的，它强调需要适当的模型来分析DNA或RNA是如何受到影响的，以及它对肿瘤发生和转移的重要作用。随着lncRNA肿瘤生物学领域的发展，不同的研究团队使用不同的方法研究那些已被研究过了的lncRNA，也导致潜在的矛盾性结果。尽管这些相互矛盾的发现可能会让人对它们的重要性产生怀疑，但其实也强调了lncRNA的复杂性，并最终会产生出更好的策略来理解它们的功能，从而有可能解决现有的差异。在之前的综述中也详细介绍了研究顺式和反式作用的lncRNA的实验方案。我们对某些lncRNA如何调节侵袭-转移级联和相关过程（例如器官特异性取向）和它们如何影响肿瘤微环境（TME）的理解正在逐渐增加（图2，3）。虽然lncRNA在癌症转移中的作用已经被其他人在综述中描述过了，但是最近发表的一些研究挑战了以前关于lncRNA功能和机制的观点。重要的是，经修饰的反义寡核苷酸（ASO）和CRISPR-Cas9及其衍生物等新工具改变了lncRNA研究的方式，揭示有关其功能的新发现，并对新的治疗靶点提供了见解。在本综述中，我们讨论了那些在体内证明lncRNA在癌症转移中有功能作用的最新研究进展，以及与这些lncRNA有关的争议。局部侵袭周围组织是肿瘤转移的必要步骤。上皮-间充质转换（EMT）及其反向对应的间充质-上皮转换，是胚胎发育和组织稳态中所激活的过程，以确保组织和器官产生正确的形态，同时对于侵袭-转移级联反应也至关重要。通过激活SNAI1、TWIST1和ZEB1等主要调节因子，具有上皮表型的癌可被赋予间质细胞的特征，这些特征允许侵袭、浸润和向远处播散。虽然许多lncRNA被发现可调节生长和侵袭，但本文将集中讨论lncRNA在侵袭和EMT中的作用，这些作用在转移的体内实验中也得到了支持（图2）。H19是最早被研究的lncRNA之一，可在一些癌症中过表达，并参与肿瘤细胞的侵袭（图3）。在膀胱癌细胞中，研究表明H19的过表达通过与多梳抑制复合物 2（PRC2）的成分EZH2相关联，驱动恶性细胞在体外迁移，导致β-catenin活性增高和E-cadherin减少，促进细胞向间质状态过渡。解释这些结果所面临的一个挑战是PRC2有发生杂乱的RNA相互作用的趋势，这可能会混淆负责H19功能的主要分子相互作用。尽管如此，H19介导的向间质特征的转化也可发生在结直肠癌（CRC）细胞中，其中H19被证明是一种ceRNA，可隔离（sequesters）miR-138和miR-200a，导致vimentin、ZEB1和ZEB2蛋白的表达升高。与其一致的是，H19在CRC细胞间质亚型中的表达高于上皮亚型。在自发性乳腺肿瘤小鼠模型中，H19在促进侵袭并最终导致转移方面的作用得到了进一步证明。H19在能够播种转移的克隆（即4T1、4T07和168FARN细胞系）中可被特异性地过表达，而具有转移能力的克隆中，短发夹RNA（shRNA）所介导的对H19的敲降，则抑制了从原发部位向远端器官（如肺、肾和肝）的转移。在这项研究中，H19作为ceRNA与miR-200b和miR-200c竞争，导致ZEB1和GIT2在原发肿瘤和远端转移中表达升高。GIT2被证明能促进远端转移瘤的定植。然而，在循环肿瘤细胞（CTCs）中，H19对miRNA let-7b有不同的海绵吸附作用，导致对CYTH3的抑制减弱，从而促进了有利于外渗的间质表型。这些研究结果突出了环境背景对lncRNA功能的显著影响，这一现象也已被观察到是lncRNA生物学的一个普遍特征。这项研究的一个优势是使用内源性Argonaut来 pulldown，这也增加了生化方面的证据支持，而不是依靠核酸序列来分析或者对ceRNA活性的间接测量，以及靶向诱变来支持H19的ceRNA作用，尽管围绕ceRNA机制仍有争议。因此，H19调节了转移启动和定植的阶梯式级联反应，并且根据细胞和环境背景，可能存在不同的作用机制。然而，上述对H19功能的研究并没有将H19转录本的microRNA吸附（sponging）能力与它本身可产生miR-675的能力分开，后者的编码区域位于H19基因的第一外显子中。在前列腺癌细胞中，高水平的H19与转移潜力降低有关，而H19编码的miR-675表达可导致TGFBI的下调，TGFBI参与了EMT的进展。因此，来自H19基因位点的转录本有可能通过分离的机制来调节侵袭-转移级联反应。尽管将单个调控功能归于一个lncRNA会比较简单，但一个在多种癌症类型中发生改变的lncRNA（如H19）可能具有更关键的作用和多种调控机制也是可信的。因此，调和这些差异需要使用能够分辨每种机制（特别是操纵PRC2相互作用位点或miRNA产物）的模型，或尽量考虑清楚所使用的每个模型又是怎样影响每种调节机制的。总的来说，这既突出了H19的重要性，也突出了研究lncRNA的复杂性。还有其他的lncRNAs也参与了EMT。其中，促转化相关的RNA（PTAR）已被证明与卵巢癌的间质亚型有关，并作为一种ceRNA与miR-101竞争，可导致ZEB1的表达升高。事实上，shRNA介导的PTAR敲除可增加E-cadherin的表达，降低FN1、ZEB1和vimentin在卵巢癌异种移植瘤中的表达。另外，与对照组相比，经腹腔注射PTAR被稳定敲除了的卵巢癌细胞后的小鼠其肿瘤结节更少，总体上也表明了PTAR在促EMT中的作用。另一个lncRNA，lncRNA-PNUTS，是从一个同时产生lncRNA（lncRNA-PNUTS）和一个mRNA（PNUTS）的基因座上转录出来的。当lncRNA作为一个ceRNA时，mRNA则产生一个蛋白磷酸酶1的调节因子。用TGFβ处理细胞可导致PI3K-Akt依赖性的磷酸化并降低随后对lncRNA-PNUTS转录抑制。LncRNA-PNUTS的表达与ZEB1和/或ZEB2间质标志物的表达相关，并被证明是一种与miR-205结合的ceRNA，使得ZEB1/ZEB2发生转录去抑制（图4）。lncRNA-PNUTS的过表达在肺癌和小鼠乳腺细胞系中可诱导EMT，表现为形态的改变、ZEB1/ZEB2和波形蛋白的表达增加，并且这种影响会被与miR-205的共转染所消除，这一结果进一步支持了lncRNA-PNUTS的ceRNA功能。将用shRNA介导敲除lncRNA-PNUTS的MDA-231-LM2乳腺癌细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫后，肺转移的负荷会减少。由TGFβ激活的lncRNA-ATB是另一个ceRNA，可作为TGFβ-ZEB1/ZEB2轴的调节因子。作为TGFβ的转录靶点，lncRNA-ATB可竞争性地与miR-200家族结合，导致ZEB1/ZEB2的上调。与这一机制相一致的是，在肝癌细胞中过量表达miR-200a则可以消除EMT。因此，lncRNA-ATB在肝细胞癌（HCC）的体内原位异种移植模型中可诱导发生EMT、侵袭、CTCs水平增加和远处器官定植。同样在HCC细胞中，lncRNA ZFAS1在基因组DNA水平发生扩增（图4），可竞争性地结合miR-150，解除对ZEB1、MMP14和MMP16基因表达的抑制，从而促进转移。另一个ceRNA，FTX的作用是竞争性地吸附miR-374a，抑制HCC细胞发生EMT和侵袭，此外还结合DNA复制许可因子MCM2，从而阻碍DNA复制，抑制HCC细胞的增殖。如上所述，lncRNA和miRNA之间竞争性结合模型经常被研究报道，在解释具有此类作用机制的实验时应小心谨慎。因为这些转录本可能存在不平衡的生理丰度和其他问题。尽管如此，PTAR、lncRNA-PNUTS和lncRNA-ATB都已被证明可在多种癌症类型中发挥作用，其重要性也得到了证实。然而，随着对这些lncRNAs的作用机制继续进行研究，就有可能发现在不同癌症类型中一致的其他机制。与干扰TGFβ信号和转录EMT通路的lncRNA不同（图3），STAT3激活的lncRNA HOXD-AS1通过隔离miR-130a-3p来解除对SOX4 mRNA表达的抑制，最终通过上调MMP2、EZH2和其他SOX4信号靶点导致迁移和侵袭增强，从而促进HCC的淋巴结转移。此外，在多个HCC细胞系中，shRNA所介导的对HOXD-AS1的抑制可降低体外迁移和侵袭（与增殖和凋亡无关）。与此相一致的是，HCC 细胞中 HOXD-AS1 被稳定敲低后所导致尾静脉注射小鼠模型中肺转移的数量减少。TGFβ反应性lncRNA MEG3可通过与EZH2相互作用并间接上调ZEB1以促进EMT。LncRNA-MUF则通过激活WNT-β-catenin信号促进CRC细胞发生EMT，同时它也可通过抑制SMAD4蛋白的降解从而导致TGFβ-SMAD2/SMAD3信号通路的激活。另外还有几个lncRNAs也被证明可以通过其他通路来调节EMT，这些lncRNAs都被总结在图3。LncRNA NORAD最早被发现的作用是通过隔离细胞质Pumilio蛋白来维持基因组的稳定性，从而维持有丝分裂和DNA修复转录本的表达，也在癌症的侵袭和转移中发挥作用（图4）。在肺癌和乳腺癌患者的样本中，NORAD的缺失与淋巴结转移有关。在体外的乳腺癌和肺癌细胞中，有研究表明异位NORAD的表达也可抑制侵袭和迁移。在同一研究中，将携带NORAD基因敲除的乳腺癌细胞静脉注射到免疫缺陷小鼠体内时，表现出有更多的肺部转移播种。从机制上讲，NORAD作为一个分子诱饵（decoy），与S100P结合并抑制其作用，从而抑制S100P介导的促转移信号，其中包括由cathepsin D和cofilin所激活的侵袭。在结肠癌患者中，CCAT2已被证明在微卫星稳定的CRC和转移性CRC中过表达。有研究表明，CCAT2可以通过与TCF7L2相互作用以激活MYC转录和WNT信号（在CRC细胞中使用RNA免疫沉淀法观察到该结果）。与这些结果一致的是，逆转录病毒载体所介导的CCAT2的过表达可增加HCT116细胞在体外的迁移，当细胞被注射到脾脏时，则会增加肝脏转移的频率。有趣的是，其他研究也描述了CCAT2通过代谢来促进转移，即通过调节选择性剪接促进谷氨酰胺酶的促糖酵解功能亚型。最近，利用转录组测序发现，与转移性CRC患者的原发肿瘤相比，lncRNA RAMS11在肝转移中过表达。使用CRISPR-Cas9对RAMS11进行基因敲除后，减少了结肠癌细胞在体外的侵袭和迁移。此外，在尾静脉和半脾切除原位模型中，RAMS11的敲除分别减少了肝转移和肺转移。这些转移表型与RAMS11依赖的chromobox homologue 4转录激活DNA拓扑异构酶II-α（TOP2A）有关。关于lncRNA调节侵袭、迁移和EMT尚未解决的问题
研究发现lncRNAs可与已知的EMT主要调控因子，如TGFβ、ZEB1、SNAI1和WNT-β-catenin通路结合，以增强或抑制其转移潜力。这些相互作用可能是直接通过核糖核蛋白复合物，或间接通过表观遗传调节因子或miRNA隔离（图1，3）。LncRNAs如NORAD、CCAT2和RAMS11可以诱导侵袭和迁移表型而不依赖这些通路。尽管这些和另外其他几个lncRNAs已被报道可促进这些过程，但它们不是孤立地发挥作用，而是通过成熟的蛋白编码调节因子，这也支持lncRNAs倾向于作为 "微调器 "而不是肿瘤转移的主调节因子这一观点。未来的研究工作将旨在证实这些lncRNAs促进EMT、侵袭和迁移的机制，并阐明采用其他各种信号通路的lncRNAs作用机制。此外，以上所描述的这些lncRNAs是否在侵袭-转移级联的其他步骤中也发挥作用还有待探讨。通过侵袭性和间质表型转化逃离原发肿瘤的恶性细胞必须进入血流，在血源性扩散过程中克服失巢凋亡（anoikis），在远端部位外渗，并在远处器官部位定植。尽管人们对lncRNAs在体内前三个细胞过程中的作用知之甚少，但有一些lncRNAs被认为与促进转移细胞在远处器官部位定植和增殖的整体能力有关。MALAT1是最早被发现参与癌症转移过程的lncRNA之一，其与肺癌转移有关，也可预测早期非小细胞肺癌患者的生存预后。在小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）-多瘤病毒中间T抗原（PyMT）模型中，MALAT1的启动子缺失或ASO介导的敲除会使得肺转移的形成减少，肿瘤分化更高（表现为囊性和包裹性肿瘤外观），E-cadherin升高（支持上皮表型）。MALAT1可以通过定位到核斑点和改变共转录的选择性剪接来调节这些功能。此外，与对照细胞相比，当MALAT1在A549肺癌细胞中的表达被抑制时（通过在MALAT1基因座上插入一个未成熟（premature）的多腺苷酸化信号），这会导致各种转移相关基因（例如ROBO1、MIA2、GPC6、LPHN2和ABCA1）的表达减少，在体外的迁移也会减少。此外，MALAT1敲除导致小鼠尾静脉注射后的肺转移减少，而且与对照组细胞相比，细胞更可能停留在血管内，这表示它们无法侵入组织。侵入肺远端部位的细胞形成了微转移，这意味着MALAT1被敲除后，其定植能力不佳。这提示了靶向MALAT1以治疗转移性肺癌的潜力，皮下注射MALAT1 ASO可减少转移性非小细胞肺癌小鼠模型的肺结节负荷。因此，在这项研究中，对基因位点和RNA转录本的扰动产生了一致的表型，这种一致性在lncRNA的研究中并不普遍，其中一些原因也取决于研究lncRNA的方法。尽管MALAT1通常被认为是一种促进肿瘤转移的lncRNA，但也有一些证据表明，MALAT1也有抑制转移的作用。在MMTV-PyMT小鼠模型中，插入未成熟的多腺苷酸化序列使MALAT1发生转录失活，并促进了肺转移，这与早期使用提前终止（除了ASO靶向）作为lncRNA失活方法的实验形成了鲜明对比。此外，以前所使用MALAT1的启动子缺失或转录本敲除的实验牵涉到该lncRNA对mRNA剪接和邻近基因表达的调节，也增加了为该基因提出不同作用机制的范围。Kim及其同事研究发现MALAT1耗竭的促转移效应可被MALAT1的转入过表达所回复（rescue）。在这项研究中，使用一些现代先进技术，如质谱全面鉴定RNA结合蛋白（ChIRP-MS），进行分析时，发现MALAT1可以与促转移的TEAD转录因子家族结合并使其转录活性失活。这会导致ITGB4和VEGFA的表达被抑制，而这些基因的表达可能是迁移和侵袭所需要的。这些不同的结果表明，lncRNA功能的表型可能不仅取决于细胞环境，如比较MALAT1在乳腺癌与肺癌中的功能，而且还取决于其主要的作用机制（例如，基因表达和剪接的调节，或转录因子的失活）。MALAT1这一例子也说明了lncRNA研究中的一个主要挑战。由于没有先验性地确定是基因组位点还是RNA基因产物（或两者都有）作为lncRNA的功能靶点，因此必须在对基因组位点或RNA转录本进行不同程度扰动的方法背景下解释lncRNA机制，因为如果从表面上看，不同的方法可能导致相互矛盾的结论。连接lncRNA和细胞因子的促定植（Pro-colonization）通路
转移性定植也需要非经典的hedgehog信号，即GLI转录网络可在不依赖于PTCH1-SMO跨膜受体的情况下被激活。在乳腺癌中，促转移转录程序的GLI2活性依赖于BCAR4，BCAR4是一种最初因其在抗雌激素抵抗中发挥作用而被发现的lncRNA。在对CCL21趋化因子信号的反应中，BCAR4与SNIP1和PPP1R10相互作用，从表观上解除对GLI2转录靶点的抑制。使用shRNA或ASO对Bcar4进行体内敲除，可抑制小鼠体内所植入的MDA-MB-231乳腺癌细胞发生肺部转移。在临床上，BCAR4的表达与乳腺癌的转移负荷相关，并且对患者的生存有预示作用，这些研究结果突出了它在转移性传播中的生物学作用及其作为疾病标志物的潜力。LncRNA-ATB除了有通过上调ZEB1和/或ZEB2以促进EMT的作用外，还能诱导小鼠皮下移植的HCC细胞在远处器官定植。这种促进定植的功能是由于lncRNA-ATB能结合并稳定IL11的mRNA，激活STAT3信号，从而抑制细胞凋亡。因此，这种lncRNA可能是侵袭-转移级联中多个步骤的重要媒介，尽管科学家们在理解ceRNA功能方面仍然存在挑战。HOX基因座上的lncRNA HOTAIR是一个相对成熟的转移调节因子。最初的研究发现HOTAIR是胚胎发育过程中某些HOXD簇基因的反式抑制因子，HOTAIR在转移性乳腺癌中过表达，也是患者生存的预测因子。在CRC患者中，HOTAIR的高表达与肝转移的发生相关。HOTAIR在非转移性SK-BR3乳腺癌细胞和具有转移能力的MDA-MB-231细胞中存在异位表达，从而导致将其进行尾静脉注射到小鼠后发生肺部定植，其中MDA-MB-231细胞还表现出持续的转移性定植和扩增。通过作为PRC2和组蛋白H3K4去甲基化酶LSD1的分子支架，HOTAIR可将乳腺癌细胞的表观基因组重编程为与胚胎成纤维细胞相似的模式。有趣的是，HOTAIR在乳腺癌细胞中的转移增强作用可以通过旁分泌机制得到加强。癌症相关成纤维细胞（CAFs）在体外分泌的TGFβ1能够通过SMAD2、SMAD3或SMAD4对HOTAIR的转录激活作用来上调HOTAIR的表达水平，从而诱导乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF-7）发生EMT。与这一结果也与先前的研究相一致，即敲除HOTAIR会减少肺部转移。尽管HOTAIR是最早被发现与转移相关的lncRNA之一，因此也有更多的研究团队剖析它的作用，也被发现能够在各种类型癌症中促进转移。由于肿瘤细胞向远处器官扩散，本文所描述的lncRNAs可以促进在通常是外来的微环境中的克隆扩张。我们需要进一步研究，以确定这种效应是否是促进生长和增殖的普遍结果，或者这些lncRNAs是否增强了转移细胞在特定环境中的相对适应性。转移性细胞表现出对特定部位的趋向性，因为不同的器官环境需要特定的适应能力才能让播散的肿瘤细胞得以生存。换句话说，特定的器官环境对播散的肿瘤细胞的生存更为有利。促进器官特异性转移的特定蛋白编码基因（如骨转移中的结缔组织生长因子（CTGF））的表达也支持这一特点，它使播散的肿瘤细胞能够克服远处组织微环境的需求。关于远处器官转移有一个悬而未决的问题，即作为女性最常见的恶性肿瘤，乳腺癌是如何以非随机的方式引起在远处器官（例如，骨骼、肺部、中枢神经系统（CNS）、淋巴结和胃肠道）发生转移的。例如，高达70%的乳腺癌转移灶散布在骨骼上，而10-30%的转移灶在大脑中。作为这样一种普遍的疾病，乳腺癌促使人们开发了几种特征明确的体内小鼠遗传模型，从而能够剖析这一重要的决策（decision-making）过程。某些lncRNAs已被发现可引导对这些器官的偏好性，其原理可能也适用于其他原发性恶性肿瘤的lncRNAs（图5）。在来自原发性乳腺癌的骨转移灶内，恶性细胞释放的旁分泌CTGF激活破骨细胞的YAP通路后可诱导分化和溶骨，从而促进骨转移灶的定植。使用高通量RNA干扰（RNAi）进行筛选，发现lncRNA MAYA是MCF-7乳腺癌细胞中YAP1激活的必要条件（图5）。在来自人类乳腺癌骨转移的细胞（BoM-1833）中敲除MAYA可导致CTGF的分泌被抑制，这会阻碍癌细胞所诱导的破骨细胞分化和骨吸收过程。在机制上，研究表明MAYA与LLG2和甲基转移酶NSUN6同在一个分子复合物中发挥作用，NSUN6使Hippo通路的组分MST1发生甲基化。然后，MST1的甲基化可导致YAP1调控基因的激活。与对照组相比，敲除BoM-1833细胞中的MAYA后，小鼠肿瘤表现出骨转移的负荷会降低。此外，静脉注射靶向MAYA的锁核酸（locked nucleic acids，LNAs）也可降低先前接种了乳腺癌细胞或A549肺癌细胞的小鼠的骨转移负荷，这表明靶向MAYA的治疗是治疗骨转移的一种潜在有效方法。与骨转移相比，转移到中枢神经系统的乳腺癌细胞会利用不同的通路来实现在特定部位的定植。来自原发性乳腺癌的脑转移瘤了表达L1细胞粘附分子（L1CAM）来拉拢（co-opt）血管内膜，使转移瘤能够在整个大脑内生长。与在原位乳腺癌细胞所产生的肺或骨转移瘤相比，Lnc-BM是一个富集在脑转移瘤中的lncRNA（图5）。Lnc-BM的表达与患者的生存期成反比，与肿瘤在中枢神经系统中的复发呈正相关。通过心内注射去除了lnc-BM的乳腺癌细胞（通过RNAi或CRISPR-Cas9）的小鼠，其脑转移的负荷会降低，同时癌细胞在脑内血管部位的增殖也减少了。从机制上讲，lnc-BM通过STAT1/3的磷酸化激活ICAM1的表达，从而允许恶性细胞以类似于L1CAM的方式招安（co-option）脑内皮细胞。此外，一旦细胞在脑内定植，lnc-BM就可介导JAK2的激活，通过CCL2招募巨噬细胞，从而调节有利于脑转移的多种信号通路。与其在X染色体失活中的作用不同，lncRNA XIST被证明与骨、肝或肺的转移相比，其会在小鼠的乳腺癌脑转移中受到抑制。与此相呼应的是，在MCF-7和SK-BR3乳腺癌细胞中沉默XIST后，并将其心内注射到小鼠体内，可导致脑转移的负荷增加。此外，在MMTV-PyMT乳腺癌自发转移的小鼠模型中，基因组敲除Xist后可通过诱导EMT和激活MET，促进干细胞表型，增强脑转移。基因敲除XIST还可导致外泌体miR-503的释放，诱导M2小胶质细胞的极化，从而改变转移的微环境。由于lncRNAs的表达和功能通常具有细胞类型的特异性（除了MALAT1和XIST等明显的例外），因此，lncRNAs可在癌症转移的器官特异性倾向中发挥重要作用也许并不奇怪。然而，目前还不清楚特定部位的lncRNA调控过程是否在转移性定植前就被触发，从而作为细胞命运的导演。或者说，lncRNAs可能通过微环境对转移性克隆的维持产生影响。抵达远处器官部位后，转移细胞形成并与TME相互作用，其中包括各种不同的过程，如血管生成、抑制和/或协同先天性和适应性免疫系统，以及基质细胞群发生重新编程以促进转移的生长。建立和维持一个支持性的微环境，包括常驻的基质细胞和先天及适应性免疫细胞，是转移性克隆生长的必要条件。通过抑制免疫系统、招募血管生成、旁分泌信号和促转移细胞外基质的沉积，TME可以不同的方式促进癌症转移。lncRNAs在肿瘤和转移性微环境中的作用正在显现出来（图6）。最初发现的NF-κB-interacting lncRNA（NKILA）是一种胞质lncRNA，可直接抑制乳腺癌细胞内的NF-κB复合物，下调后导致转移潜力增强（图6a），NKILA也在STAT1-组蛋白乙酰化依赖机制中调节T淋巴细胞内在的抗肿瘤活性（图4，6b）。在乳腺肿瘤浸润性T细胞中，NKILA会抑制NF-κB信号，导致这些T细胞发生活化诱导的细胞死亡（图6b）。用shRNA敲降CD8+T细胞中的NKILA，并转移到乳腺癌异种移植小鼠模型时，会增加它们对肺部的渗透，这些T细胞会上调穿孔蛋白和CD107a的表达，并表现出更高的抗肿瘤活性。CD8+T细胞的衰竭也可以通过lnc-Tim3诱导，它被证明可以促进p53和RelA转录靶标发生激活。而NKILA对肿瘤细胞和免疫细胞中的NF-κB通路有负向调节作用，lncRNA CamK-A被证明可以通过降解IκB来激活乳腺癌细胞中的NF-κB通路，以应对缺氧引起的钙流入（图6b）。这会导致IL6、IL8和VEGF（以及其他基因）的基因发生转录激活，在患者来源的乳腺癌异种移植模型中促进巨噬细胞招募和血管生成。一致的是，来自CamK-A 缺陷型乳腺癌细胞的条件培养基未能在 HUVEC 内皮细胞培养物中诱导血管生成，而来自CamK-A增强型（proficient）细胞的条件培养基则诱导了血管生成。调节性T细胞有助于避免肿瘤中的免疫监视，它也受到lncRNA活性的影响。在CD4+T细胞中，lnc-EGFR被证明能与细胞质EGFR结合，从而稳定其下游信号转导。进而导致FOXP3的诱导，标志着向调节性T细胞系的分化。与这种抑制性免疫细胞群的扩张相一致，当这些细胞被植入HCC异种移植模型时，T细胞中lnc-EGFR的过表达可导致肿瘤生长比对照组更快。在膀胱癌中，LNMAT1可在淋巴结阳性的膀胱癌中过表达，并且对膀胱癌患者的总生存期有预示作用。ShRNA所介导的LNMAT1敲降可减少所注射到裸鼠脚垫的膀胱癌细胞发生淋巴结转移。然而，LNMAT1的功能不是肿瘤细胞所固有的，因为转导了LNMAT1的膀胱癌细胞的条件培养基能够刺激巨噬细胞的激活，而且这种效果可以被CCL2中和抗体所抑制（图6c）。有趣的是，LNMAT1可通过与CCL2启动子形成DNA-RNA三联体来激活CCL2的表达，并促进有转录活性的组蛋白修饰（H3K4三甲基化）的沉积。此外，LNMAT1过表达还可通过巨噬细胞依赖的VEGF-C128上调以增加体外淋巴管的生成。因此，lncRNAs可对微环境产生显著的非细胞自主性影响。LncRNAs是祖细胞、先天和适应性免疫细胞分化和功能的关键调节因子。此外，lncRNAs对于神经、肺、心脏和胚胎组织的发育和生理功能也是必要的。由于所有这些细胞类型都能影响转移性微环境或转移前生态环境（niche），因此可以想象有更多的lncRNAs也会参与其中。转移性癌症患者的存活率很低，对治疗的抵抗仍然是治疗过程中的一个主要障碍。改善癌症治疗的一个重要方法是利用组织和癌症特异性表达谱来，以开发可预测从原发疾病到转移性疾病进展的标志物。虽然lncRNA PCA3已被确定为前列腺癌的无创性前期诊断标志物，具有可靠的检测特性并被用于临床。根据对1008名患者的芯片分析，lncRNA SChLAP1的过表达对前列腺切除术后10年内发生前列腺癌转移具有独立预测作用。在手术时将SChLAP1的检测应用于患者的风险分层，可能有助于实现精准医疗策略，以对侵袭性肿瘤进行积极治疗。事实上，SChLAP1的表达是前列腺癌的临床实践中基因组分类器（classifier）的一个重要组成部分。从机制上讲，SChLAP1可结合并拮抗SWI/SNF复合物，导致SNF5的全基因组占有率（occupancy）下降，其靶基因的表达减少。因此，当22Rv1前列腺癌细胞被通过心内注射到SCID小鼠模型中时，SChLAP1被敲除了的，其转移性播种会减少。然而，SChLAP1的这一潜在（proposed）机制也受到了挑战，因为随后的研究表明，SChLAP1的过表达并没有将SWI/SNF复合物从染色质中分离（evict）出去，这表明SChLAP1在前列腺癌转移中的作用机制与SWI/SNF无关。SChLAP1的机制有可能是背景或细胞类型的特异性，同时仍然保持作为临床预后指标的效用。转移性癌症患者的临床结局差异很大，尤其是不同组织学的转移性癌症患者。在转移性肾细胞癌（RCC）患者中，与lncARSR表达水平低的肿瘤相比，lncARSR高表达预示患者的总生存期较短。lncARSR可通过隔离miR-34和miR-449，导致AXL和MET表达发生去抑制（derepression），从而导致对舒尼替尼的抗性。lncARSR通过外泌体在细胞间穿梭，能够以旁观者的方式促进耐药性的发生。与lncARSR可导致舒尼替尼的耐药性相一致，在RCC的原位异种移植模型中，静脉注射可靶向lncARSR的LNA ASO，可使其对在同时进行的舒尼替尼治疗敏感。在两个独立的结肠癌患者队列中，RAMS11的表达与患者的预后不良有关。有趣的是，FDA 批准的药物筛选结果显示，RAMS11表达的增加会促进对氟西卢定（FUDR）（一种常用于治疗转移性CRC的化疗药物）和拓扑异构酶抑制剂的抵抗。事实上，用CRISPR敲除了RAMS11细胞表现出对FUDR和拓扑异构酶抑制剂的敏感性增加。要将RAMS11的预后和预测作用转化为临床试验，还需要进一步的工作。值得注意的是，迄今为止所讨论的生物标志物的发现可能仍处于早期阶段。虽然SChLAP1在转移性进展的患者中的表达量比没有转移性进展的患者高，但许多具有癌症或组织特异性表达的lncRNAs可能并没有足以作为可靠生物标志物使用的高表达水平。展望未来，越来越多的转录组测序数据将大大促进lncRNA生物标志物的发现。然而，独立验证仍是至关重要的，对lncRNAs来说也可能更具挑战性。重要的是，只有一部分芯片平台包含有监测RAMS11和SChLAP1表达的探针，以能够在具有长期临床结局数据的患者人群中进行独立验证。然而，许多lncRNAs不会被任何现有的芯片平台所捕获到。尽管一些研究可能在小型独立队列中使用基因特异性验证，但更广泛地应用一种生物标志物需要系统地比较一种lncRNA相对于现有蛋白编码基因生物标志物的诊断或预后意义。鉴于特定癌症类型（如前列腺癌）的随访时间较长，再加上需要对转移性终点有详细说明的临床随访，这可能需要利用以往的回顾性队列。此外，由于患者病情发展和对治疗反应的复杂机制，单一的lncRNA可能不是最有用的生物标志物，相反，潜在的lncRNA生物标志物需要与蛋白编码基因一起来进行评估。展望未来，考虑以非侵入性方式可靠地检测推定的（putative）lncRNA生物标志物的能力也很重要，以尽量减少对活检的需求。这对于使用lncRNA生物标志物对重复肿瘤活检不可行的患者进行连续监测尤为重要。总的来说，SChLAP1、lncARSR和RAMS11突出了lncRNAs在癌症治疗反应中的作用，以及它们作为预后和预测性生物标志物的潜在用途。通过体内转移性疾病的临床前模型，lncRNAs已经显示出了作为癌症治疗靶标的前景。例如，我们在上面讨论的lncRNAs MAYA、MALAT1和lncARSR，都是使用ASO进行体内沉默的靶标，以减轻小鼠模型中转移性疾病的负荷。然而，当使用ASO疗法靶向lncRNAs时，确保只发生最小的脱靶效应则至关重要，鉴于体内lncRNA转录本的丰度通常较低，这可能会带来进一步的问题。新的证据表明，除了RNase H所介导的成熟RNA发生降解外，ASO还可通过过早的（premature）转录终止来破坏目标RNA，在预测ASO疗法的活性时应考虑这一点。某些ASO也被观察到有肝毒性，ASO的化学修饰已被证明可以减轻这种毒性和脱靶效应。一个更大的实际问题是如何优化ASO的传递/给药路径，以增加可靶向lncRNAs或蛋白编码基因的ASO的影响, 这是一个重要的研究发展领域。尽管有这些挑战，但令人欣慰的是，在癌症的小鼠模型和临床试验中，蛋白编码基因已成为靶标，如脊髓性肌肉萎缩症患者的SMN2、难治性淋巴瘤的STAT3和克罗恩病的SMAD7。也许，靶向lncRNAs治疗癌症转移这一曾经的崇高愿景变得很有希望。尽管许多开创性的研究证明了lncRNAs在整个转移过程中的作用（图2），但仍有很多知识空白。特别是细胞转化和远处定植之间的侵袭-转移级联的步骤，包括外渗、血源性播散、内渗和微转移的形成，lncRNAs的作用还没有得到充分的证实。要克服这些局限，需要从转移的细微阶段（如原发肿瘤、CTCs、微转移和明确的转移）获得更多与病人实际情况匹配的分子数据。此外，本综述中所讨论的大多数lncRNAs都有增强转移潜力的作用。这些研究结果是lncRNA生物学的固有属性，还是各自研究中方法学偏差的结果，还有待确定（大家可以在原文补充材料table1查看作者的总结）。尽管如此，对那些可能抑制转移的lncRNA进行额外研究仍有必要。总结lncRNAs在不同癌症类型的转移过程中的作用也是难以捉摸的，也许这应该是因为大多数lncRNAs具有细胞类型特异性的功能。由于对癌症中的lncRNAs的表征仍然落后于其对应的蛋白编码基因，因此还需要改进方法，以准确地重现人类疾病的实验模型中所发现的lncRNAs机制。lncRNA生物学领域的另一个难题是，为什么看似不同的lncRNA倾向于汇聚在几个稳定的蛋白质编码通路上，而不是作为独立的转移调节因子发挥作用。这可能是几十年来对蛋白编码基因的研究使关键的转移调节基因得以发现和汇聚，而对许多lncRNAs的研究却处于比较初级的阶段，使得类似的lncRNA还没有被发现并在独立的实验中得到验证。然而，新出现的数据表明，"功能保护（conservation）"而不是主要序列或二级结构保护可能是lncRNAs的另一个突出特点。此外，多种RNA种类与蛋白编码基因相互作用时有可能发挥着类似的角色，PRC2对RNA相互作用的要求也突出了这一概念，尽管会表现出杂乱的蛋白质-RNA相互作用。综上所述，可以想象，即使是由基因组中不同位置产生的具有不同序列的lncRNAs，也可以影响一组类似的有效转移通路。LncRNAs不仅是一般癌症标志的重要调控者，也是转移的发病机制中的关键角色。近年来，随着更多的lncRNAs被表征，很明显，lncRNAs在侵袭-转移级联、远处器官定植和TME中都发挥着重要作用。通过与促进或抗转移的蛋白复合物一起发挥作用，或直接与其他RNA类型或DNA相互作用（如RNA-DNA三螺旋），lncRNAs可通过不同的机制对癌症通路施加影响。悬而未决的问题仍然存在，如lncRNAs在CTCs中的作用、在转移前生态环境的形成和在基质细胞中的特定功能。未来的研究需要对这些过程进行研究，并进一步明确lncRNAs参与转移的机制。展望未来，除了选择适当的模型使lncRNA失活外，实验室进行适当的基因回复（rescue）实验也是至关重要的。不同研究者之间的独立验证结果也将是必要的。在进行这些努力的同时，了解各种方法对解释lncRNA功能的影响，并对lncRNA功能的不同可能性持开放态度也是至关重要的。LncRNAs也是一个尚未被重视的新型治疗靶标。它们在癌症进展中的不同作用为在临床上阻止转移提供了新的机会。如与目前用于治疗疾病的反义寡核苷酸类似，随着lncRNAs体内靶向技术的成熟，将极大地促进可靶向转移瘤的lncRNA疗法的实现。
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