题目：Host-microbiota interaction-mediated resistance to inflammatory bowel disease in pigs
发表杂志：Microbiome
发表时间：2022年7月30日
第一作者：赵轩
通讯作者：石宝明、孟庆维
单位：东北农业大学
影响因子：16.837
DOI：10.1186/s40168-022-01303-1
原文链接：https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-022-01303-1
摘要
背景：抗病表型与免疫调节功能和免疫耐受有关，影响畜禽与人类健康。微生物在宿主的免疫和自身免疫调节中发挥着重要作用，但宿主-微生物相互作用对抗病表型的影响尚不清楚。本研究通过多组学分析，确定了两个猪品种在微生物和宿主水平上抗病的潜在调控机制。
结果：本研究建立了民猪和约克夏猪结肠炎模型，并比较对照组和疾病组。在相同的营养和管理条件下，与约克夏猪相比，民猪表现出较强的抗病性，表现为较低的疾病活动指数（DAI）和较低的组织学活动指数（HAI）。微生物测序分析显示，这两个品种的疾病个体均富含有害微生物：Desulfovibrio、Bacteroides和Streptococcus。值得注意的是，有益菌如Lactobacillus、Clostridia和Eubacterium，以及属于Ruminococcaceae和Christensenellaceae的几个菌属富集在疾病组的民猪中，并与肠屏障功能有关的微生物代谢物呈正相关。此外，吲哚衍生物和短链脂肪酸（SCFA）的浓度在疾病民猪中增加，这提示它们在保护肠道屏障方面发挥着有益的作用。在疾病的约克夏猪中观察到较低浓度的胆汁酸代谢物和短链脂肪酸，这与有害菌增加相关，如Bilophila和Alistipes丰度的增加。在免疫应答方面，固有层中CD4+T细胞的增加改善了疾病民猪的免疫应答，有助于维持Th2型免疫优势和免疫耐受，并在有益菌的帮助下控制炎症。在疾病的约克夏猪中，更多免疫生物学过程富集，包括Toll样受体信号传导，NF-κB信号传导和Th1和Th17型免疫应答，以及有害菌增加和肠屏障受损。
结论：两个猪品种的结果表明宿主-微生物互作以三种方式促进抗病表型：通过维持部分PRR非活化、维持Th2型免疫优势和免疫耐受模式并恢复肠屏障功能以防止结肠疾病。
背景
肠道中微生物群落不同，表现出巨大的个体间变异。宿主和微生物之间数百万年的共同进化导致了一种互惠互利的关系，其中微生物可能介导宿主的生理适应性。具体而言，宿主的生理状态可能被微生物诱导的细胞信号传导和增殖改变，导致粘膜、屏障功能和免疫应答的变化，从而影响表型。鉴于微生物对宿主生理和免疫系统的诱导和功能的广泛影响，宿主和微生物群的组合有可能在很大程度上驱动抗病表型的发展。对疾病的免疫反应是宿主抗病表型的重要指标，其差异取决于微生物的组成。宿主-微生物之间的相互作用涉及多种肠道相关疾病，包括腹泻、肠毒血症和炎症性肠病（IBD）。这些疾病的特征是微生物生态失调和宿主体内平衡的扰动，但在不同的抗病表型中微生物变化的作用尚未完全确定。此外，肠道微生物是否以及在多大程度上驱动疾病，或者在应对疾病时发生改变，目前尚不清楚。针对不同抗病表型的干预研究需要解决这一差距。鉴于不同猪品种的微生物群的重要性和复杂性，人们对确定微生物群的组成及其功能越来越感兴趣，以更好地理解抗病表型形成的机制。
约克夏猪是世界范围内常见的商品猪品种，这个品种的猪适应各种环境，并表现出一定的抗病能力。民猪是中国本土品种，比约克夏猪具有更强的抗病性。以前的研究表明，与其他品种相比，民猪在断奶后期达到腹泻高峰，腹泻负担较低。与约克夏猪等其他品种相比，民猪的抗病性更好，这可能为鉴定有效的微生物提供了一条途径。最近，作者发现民猪粪便微生物转移（FMT）可以调节约克夏仔猪的肠道微生物群，并增加免疫球蛋白和抗菌肽水平，这表明民猪的微生物群可以通过影响宿主生理来增强约克夏猪的机体健康。这也部分解释了为什么民猪的抗病性强于约克夏猪。虽然作者已经确定了微生物与疾病之间的关联，但是在相同的营养和管理下，与约克夏猪相比，民猪的某些核心细菌如何有助于形成抗病表型仍然不清楚。作者假设约克夏猪可能缺乏重要的宿主-微生物群相互作用，导致在疾病和炎症免疫刺激的压力下宿主适应性较弱。DSS诱导的结肠炎是急性结肠炎与人类溃疡性结肠炎类似的一种成熟模型。溃疡性结肠炎是IBD的一种，可被视为受宿主-微生物平衡紊乱强烈影响的自体免疫性疾病。因此，在本研究中，作者采用DSS诱导的结肠炎模型来鉴定某些共生菌及其代谢产物，这些共生菌及其代谢产物可能影响宿主的生理适应性，进而影响IBD的易感性。本研究提供了关于肠道微生物和宿主表型之间潜在联系的信息，并可能有助于筛选与宿主健康相关的核心肠道微生物候选物。
结果
民猪和约克夏猪不同的抗病表型可能与肠道菌群组成和肠道生物学功能有关。因此，作者首先确定民猪和约克夏猪之间是否存在明显的表型差异。作者比较了民猪结肠炎模型（M-CON vs M-DSS）和约克夏猪结肠炎模型（Y-CON vs Y-DSS）（图1a）。采用DAI和HAI评价方法比较对照组与DSS诱导的结肠炎模型的疾病严重程度。与M-CON和Y-CON猪相比，M-DSS和Y-DSS猪DAI和HAI升高，证实实验性结肠炎建立成功。虽然在M-DSS和Y-DSS猪中都观察到损伤，但Y-DSS猪表现出更早和更严重的机体损伤，具体表现为高水平的体重减轻、粪便粘稠度和便血评分增加，以及大范围的黏膜损伤和隐窝丢失（图1b、c、g）。这些结果表明，两个猪种的抗病性存在差异。此外，Y-DSS猪脾脏和结肠显著增大，结肠长度显著缩短，表明Y-DSS猪具有严重的炎症（图1d-f）。
作者接下来尝试确定两个猪品种的对照和疾病个体的菌群组成。作者使用richness和Shannon指数计算α-多样性，Y-CON和Y-DSS猪的α-多样性没有差异，但M-DSS猪的α多样性略低于M-CON猪（图2a）。通过非加权Unifrac距离测量，DSS诱导的结肠炎猪与对照猪的β-多样性具有显著差异（图2b）。为了进一步了解这两个品种的对照和疾病个体之间的微生物差异，作者测定了结肠微生物的分类组成。M-DSS猪Firmicutes丰度增加，Bacteroidetes和Spirochaetes的丰度大幅下降（图2c）。对属于Firmicutes的科水平进一步分析发现，在M-DSS猪的结肠中，Ruminococcaceae、Christensenellaceae和Lactobacillaceae的丰度有所增加。在属于Bacteroidetes的科中，Prevotellaceae和Muribaculaceae的丰度减少，而Bacteroidaceae丰度增加。约克夏猪的结果却不同（图2d）。在门水平上，与Y-CON猪相比，Y-DSS猪Firmicutes的丰度减少，Bacteroidetes、Proteobacteria和Spirochaetes的丰度增加（图2c）。丰度下降的厚壁菌门包括Lachnospiraceae、Christensenellaceae和Lactobacillaceae，丰度增加的Bacteroidetes包括Prevotellaceae和Bacteroidaceae（图2d）。
为了确定两个品种特有的菌属，作者使用LEFSe进一步评估动物间细菌组成的差异（图3a和b）。数据表明，与肠道炎症相关的Bacteroides、Desulfovibrio和Streptococcus在两个品种的疾病个体中富集，而在两个品种的疾病个体中Muribaculaceae和Blautia的丰度则减少（图3c和d）。约克夏猪生态失调的另一个关键特征是疾病个体表现出富集Gammaproteobacteria、Bilophila、Veillonella和Prevotellaceae，以及缺少Eubacterium、Dorea、Butyricicoccus和Lachnospiraceae。有趣的是，许多有益菌，如Ruminococcaceae_UCG-02、Ruminococcaceae_UCG-10、Lactobacillus、Clostridia、Eubacteriumh和unclassified Christensenellaceae，在M-DSS猪中增加了（图3d），但在Y-DSS猪中却没有增加。
两个品种的结果表明，共生菌可能在民猪结肠炎的抗性中起重要作用。基于细菌群落的表型预测结果与作者的实验结果非常吻合（图4a）。革兰氏阴性菌是最常见的致病菌。在M-DSS猪中，革兰氏阴性菌丰度显著下降，同时革兰氏阳性菌丰度增加，提示潜在致病性降低。预测结果还表明，M-DSS猪的潜在致病性降低，Y-DSS猪的潜在致病性增加。通过KEGG图谱来确定微生物组的功能（图4b）。在KEGG图谱中，第三层级中微生物代谢途径，包括脂多糖生物合成、鞘脂代谢、β-丙氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢和色氨酸代谢富集于两个品种中。一些途径，如丁酸盐代谢，仅在约克夏猪中富集。
为了进一步了解DSS处理后两个猪品种的代谢变化，作者对结肠内容物进行了非靶向代谢组学分析。在结肠代谢组中共鉴定出1578种化合物。PLS-DA结果表明DSS处理后结肠代谢物发生了显著变化（图5a）。各组代谢物之间存在相关性（图5b）。对代谢物的差异倍数、t检验和VIP过滤分析表明，51种代谢物在民猪中存在显著差异，其中M-DSS猪中26种代谢物显著升高，25种代谢物相对较低（图5c）。Y-DSS猪中与Y-CON猪相比，共有93种代谢物存在显著差异，其中31种代谢物上调，62种代谢物下调（图5c）。
维恩图显示两种比较（M-CON与M-DSS，Y-CON与Y-DSS）之间共有的10种差异代谢物（图6a）。九种差异代谢产物在两个品种的对照品种和疾病个体之间表现出相同的趋势；另一种代谢产物苯胺显示出相反的趋势。苯胺在M-DSS猪中显著高于对照组，但在Y-DSS猪中显著低于对照组（图6b）。为了确定变化的代谢产物的功能，作者进行了KEGG富集分析（图6c和d），结果与微生物组功能基本一致。在M-CON与M-DSS和Y-CON与Y-DSS的比较中富集的常见途径包括亚油酸代谢，氨基酸的生物合成，谷胱甘肽代谢和β-丙氨酸代谢。值得注意的是，与β-丙氨酸代谢相关的代谢产物显著改变，两个品种之间变化趋势相反。这些代谢产物在M-DSS猪中增加，表明该途径的激活，但在Y-DSS猪中减少。与M-CON猪相比，M-DSS猪具有精氨酸生物合成、色氨酸代谢和抗生素生物合成的特异性途径。具体而言，作者发现参与抗生素生物合成的一些中间代谢产物，如鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-色氨酸，在M-DSS猪中显著增加。所有参与色氨酸代谢并显著变化的代谢物在M-DSS猪中上调（图6e），表明民猪可能通过增加色氨酸代谢而进行适应性调整。与Y-CON猪相比，Y-DSS猪的特异性代谢途径为鞘脂代谢、硝基甲苯降解和牛磺酸、亚牛磺酸代谢。与Y-CON猪相比，参与这些途径的主要中间代谢物，如亚精胺、鞘氨醇和乙酸在Y-DSS猪中下调（图6e）。除了通过代谢组学之外，作者还定量测定了总短链脂肪酸（SCFAs）、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸的绝对浓度（图6f）。M-DSS猪的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和异戊酸均显著高于M-CON猪，但Y-DSS猪的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和异戊酸均低于Y-CON猪，说明约克夏猪在结肠炎期间的自我调节能力相对较低。
肠屏障功能主要包括物理屏障、生态屏障和免疫屏障三个部分。生态屏障的紊乱（微生物失调）往往导致机械屏障和免疫屏障的功能障碍。为了探讨核心菌群保护宿主结肠的潜在机制，作者采用RNA-seq对两个品种的结肠基因表达进行了定量分析。图7a显示了基因在对照和疾病的民猪和约克夏猪之间的分布的火山图。与M-CON猪相比，M-DSS猪中共有322个基因上调，159个基因下调，与Y-CON猪相比，Y-DSS猪中有231个基因上调，174个基因下调（图7b）。为了深入了解对照和疾病的民猪和约克夏猪之间差异调节的免疫屏障和机械屏障的生物学过程，进行GO富集分析（图7c-f）。与M-CON猪相比，M-DSS猪体内富含多种免疫应答，包括对细菌的应答、免疫应答、炎症反应、急性期反应、2型免疫反应、CD4阳性、α-βT细胞活化、辅助性T细胞1型免疫反应的负调节、CD8阳性、α-β-T细胞活化的负调节、抗菌肽介导的抗菌体液免疫反应、Toll样受体信号传导途径和Myd88依赖性Toll样受体信号传导途径。通过qRT-PCR验证，TLR7和TLR8基因的表达趋势与RNA-seq结果一致，在M-DSS猪中下调（图7d）。在Y-DSS猪中，GO分析结果显示，与Y-CON猪相比，属于免疫生物过程和肠道结构的通路富集：对细菌的反应、炎症反应、抗菌肽介导的阳性抗菌体液免疫反应、Toll样受体4结合和免疫反应。少数通路在Y-DSS猪中富集，但在M-DSS猪中不富集，例如NIK/NF-κB信号的调节和I-κB激酶/NF-κB信号的正调节。这些通路中的基因在Y-DSS猪中上调，表明约克夏猪的炎症加重。一些与免疫反应有关的途径，包括IL-8分泌、IL-6分泌、TNF-α反应、IFN-γ和辅助性T细胞17型免疫反应应答，也在约克夏猪中被激活。这些结果表明，Th17型免疫反应，一种炎症性自身免疫病的重要驱动因素，在约克夏猪中占主导地位。
由于在RNA-seq分析中富集了与物理屏障和免疫屏障相关的通路，因此作者在结肠样本中检测了相关的免疫通路。在免疫屏障方面，M-DSS猪的免疫细胞差异最显著，CD4+T细胞水平显著高于M-CON猪。相反，Y-DSS猪的CD8+T细胞水平显著高于Y-CON猪（图8a、b）。
炎性细胞因子中IL-4、IL-6、IL-10、IL-23和IFN-γ水平在M-DSS组显著升高。IL-4，IL-6和IL-10是2型免疫应答的主要调节因子。与Y-CON猪相比，Y-DSS猪IL-1β、IL-2、IL-8、IL-17、IL-23、IFN-γ和TNF-α水平升高（图9a）。PRR基因中，M-DSS猪TLR2和TLR7下调。TLR2、TLR3、TLR4、TLR8、NOD1和NOD2在Y-DSS猪中显着上调（图9b）。M-DSS猪和Y-DSS猪结肠中的IgA和sIgA水平均增加。M-DSS和Y-DSS猪的pIgR水平增加，但Y-DSS猪的增加程度更大（图9c）。在物理屏障方面，与民猪不同，在Y-DSS猪中紧密连接蛋白如occludin，claudin-1和ZO-1水平下调（图9d）。综上所述，这些结果表明约克夏猪更容易受到炎症刺激，从而导致持续的炎症。
总结
本研究使用微生物测序、代谢组学、转录组学和其他分析发现了以不同抗病性的品种对宿主-微生物群相互作用的影响（图10）。作者的研究表明，随着有益菌的增加和肠道屏障的稳定，M-DSS猪中PRR稳定得以维持。作者的数据还表明，M-DSS猪中CD4+T细胞的增加，而在Y-DSS猪肠道中却没有发现这一现象，这可能与M-DSS猪Lactobacillus和色氨酸代谢的增加有关，从而维持了Th2型免疫优势和免疫耐受模式。此外，关联分析显示，Lactobacillus、Christensenellaceae、Eubacterium和SCFA浓度之间存在正相关关系，这表明它们有助于保护民猪肠道屏障。越来越多的证据表明，宿主-微生物群的相互作用与IBD疾病的进程有关，因此，这项研究的结果可能有助于筛选与宿主健康相关的核心肠道候选微生物，并促进从提高免疫力作为抗炎策略的思维转变为免疫抑制作为抗炎策略。
通讯作者
- 石宝明 -
东北农业大学动物科学技术学院
动物营养与饲料科学系二级教授
近年来，石宝明教授团队致力于地方畜禽肠道微生物资源挖掘和利用，现筛选并保藏民猪源菌株3株，授权专利1项。应用民猪源益生菌制备的抗病微生态制剂和生物发酵饲料显著地改善猪禽健康、提高生产性能。
- 孟庆维 -
东北农业大学动物科学技术学院
动物营养与饲料科学系副教授
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