（文章翻译整理自文献doi.org/10.1002/sctm.21-0083，侵删）
突然发现了韩忠朝院士团队近期发表的一篇文章，介绍了间充质干细胞药物开发的流程。通读下来发现该文章对整个流程尤其是整个流程的监管要求进行了很详细的梳理，但是对于研发内容还是做了很好的区分保护，基本属于101系列。
长文预警。
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间充质干/祖细胞（MSCs）由于具有自我更新、高可塑性、分化能力、免疫应答和调节等特点，在再生医学领域具有广阔的应用前景。将MSCs 转化为临床应用的兴趣从未像现在这样高。许多生物技术公司从临床级 MSC 产品的开发到研究性新药(IND) 研究投入了巨大的努力。因此，中国对MSC 法规的需求不断增长，需要在可访问的专业期刊上进行各种讨论。国家药品监督管理局对间充质干细胞疗法临床应用实施了规定。近年来，我国对MSCs产品作为药物的法规进行了更新。本次审查将审视异体MSC开发的整个过程，包括法规、指南、流程、质量管理、IND前会议以及获得在中国启动临床试验批准的IND申请。该审查侧重于MSCs 产品开发过程中的流程和监管挑战，旨在提供满足监管要求的策略。本文描述了科学家、生物技术公司和临床试验研究人员成功开发基于MSC 的治疗产品的途径。
意义声明
本研究基于间充质干/祖细胞(MSCs) 产品开发的科学性和合规性。本文重点介绍了中国异体MSC药物开发的全过程，包括法规、指南、流程、质量管理、预研新药（IND）会议以及获得临床试验批准的IND申请。这项研究的结果对于有兴趣开发MSCs 产品和其他细胞治疗产品的研究人员来说将是有价值的。
1 引言
间充质干/祖细胞(MSC) 来源于广泛的人体组织来源，例如骨髓、脂肪、牙髓、脐带、胎盘、羊膜,子宫内膜组织,脐带血, 外周血,和角膜缘,等等。在过去的20 年中，MSC 已成为用于治疗应用的最有希望的候选细胞之一，因为它们在抗炎、促血管生成、免疫调节和特定条件下的多向分化能力方面发挥着重要作用。MSCs 具有低免疫原性，在给药前无需匹配 HLA。从少量起始生物材料扩大规模相对容易。体内研究已经很好地证明了它们在各种模型中的效力、功效和稳定性，以支持潜在的临床应用。全世界有800 多项注册的 MSC 临床研究和55 000 多篇关于 MSCs 的出版物。目前了解MSC作为医疗药品开发的监管问题的需求不断增加。
大多数 MSCs 产品符合2006 年国际细胞治疗学会 (ISCT) 定义的MSCs 最低表征标准，其中包括表达一组特定的分化簇 (CD) 标志物（即CD105、CD73、CD90)、缺乏通常与造血谱系细胞相关的某些其他标志物（即 CD45、CD34、CD14、CD19和 HLA-DR）的表达，以及三谱系潜在分化能力。但是当MCS作为治疗特定适应症的药品时，这些标志物是不明确的。在MSC 产品开发过程中考虑这些细胞标志物时，需要确定其特性和纯度，尽管世界上大多数监管机构并不要求将纯的MSCs 群体用作临床产品。
在美国，用于培养扩增的 MSC 产品受《公共卫生服务法》（PHS法；42 USC 262）第351 条的监管，并要求向美国食品药品监督管理局 (FDA) 提交研究性新药(IND) 申请以在临床试验中测试。
在欧盟，基于 MSC 的医药产品开发和授权由欧洲药品管理局(EMA) 监管。 EMA成立了先进疗法委员会（CAT），负责MSCs的认证和评估程序。根据中国现行的法律法规，MSCs在临床研究中的使用需要通过两种方式之一获得批准。一方面，中国卫生部在伦理委员会审查和合格定点医院批准的基础上实施了MSCs治疗临床应用的规定。反之，如果MSCs 打算作为一种医疗药物进行开发，那么使用 MSCs 产品进行的临床试验需要根据国家药品监督管理局(NMPA) 的规定获得国家药物评价中心 (CDE) 的IND 批准。 IND申请必须由申请人提交，并提供全面的信息，包括细胞和制造工艺的开发、质量标准、质量控制、MSCs产品的稳定性研究、功效研究、安全性和毒性研究以及临床试验计划和建议。MSCs 产品必须根据 IND 规定在良好生产规范(GMP) 条件下生产。本次综述将概述MSCs 产品制造商获得IND 申请批准的监管和程序。
2 MSCs 药物开发概述
一般来说，MSCs 产品的开发包括几个关键阶段，包括以下（图1）：
基础研究阶段包括MSCs分离、纯化、细胞特性分析、细胞培养基开发、扩增和作用机制(MOA) 用于建议的适应症。
药学主要包括化学生产控制、产品检测和放行、稳定性程序等。
药理学试图确定目标适应症、巩固预期的作用机制、确定给药途径、确定生物活性剂量、确定疗效、证明安全性和药代动力学等。
毒理学应考虑单剂量毒性试验、重复给药毒性试验、致瘤性研究、遗传毒性、生殖毒性、抗原性试验、免疫毒性试验、局部耐受性等。
IND 申请包括pre-IND 会议、IND 申请文件和IND 提交。
临床试验包括探索性临床试验和验证性临床试验。
3 适用于MSCs 产品的法规和指南
所有供人类使用的医药产品的开发必须遵守法律要求的约束。在美国，MSC和其他基于细胞的医药产品属于生物制品评估和研究中心 (CBER) 的职权范围，特别是细胞组织和基因治疗办公室(OCTGT)，后者负责监管人体细胞等产品、组织、细胞和基于组织的产品，根据CFR 标题 21 第1271 部分。在欧盟，MSC 和其他基于细胞的医药产品属于先进治疗医药产品(ATMP) 的职权范围，包括体细胞治疗医药产品、基因治疗医药产品和组织工程产品。在日本，自2014 年以来，人体细胞、基因或组织衍生药物受到《药品和医疗器械法》（PMD Act）的监管。在中国，它以《中华人民共和国药品管理法》为指导。《中华人民共和国药品管理法》由中国人民代表大会于1984 年首次发布，现行版本于 2019 年24 月进行了修订。随后根据该法成立了 NMPA。国家药监局负责制定药品质量标准、药品管理规定、安全监督管理。NMPA 成立了药品审评中心 (CDE)，负责药品审评和评价。中国所有细胞疗法均受NMPA 《2017 年细胞治疗产品研究和评价技术指南》的监管。它包括干细胞产品、免疫细胞产品和基因编辑的细胞产品。此外，NMPA于2020年4月26日更新了《药品生产质量管理规范》的生物制品附录。国家药品监督管理局起草了《药品生产质量管理规范（2010年修订）》的细胞治疗产品附录（草案）征求意见）。同时，2020年8月4日，国家药监局还起草了《人源干细胞及衍生细胞治疗药物临床试验技术指南（征求意见稿）》。新药开发需要遵守现行的《中国药典》和其他国家药品标准。NMPA于 2017 年被国际人用药品技术要求协调委员会(ICH) 批准为新的监管成员，ICH 发布的所有指南都将获得NMPA 的批准。因此，医药研发企业可以参考ICH的指导方针。关于细胞疗法的进一步参考可以参考美国食品药品监督管理局（FDA）、欧盟欧洲药品管理局（EMA）、美国肠外药物协会（PDA）、现行良好组织规范的法规和指导文件(GTP)在美国和国际制药工程学会 (ISPE)。
4 化学、制造和控制（CMC）
4.1 符合GMP的质量管理体系建立与实施
GMP 是一个质量保证体系，可确保MSC 产品的生产和控制始终符合适用于临床使用的最先进的质量标准。因此，临床级 MSCs 应遵循GMP 指南，按照 IND 法规在药品质量方面进行生产。GMP原则有助于为消费者和患者提供具有一致质量和高安全水平的产品。为符合这些原则，制造商必须建立、实施和维护药品质量体系。药品质量体系应监督所有活动，从原材料来料控制、制造、测试、人员、设备、标签、生产记录审查、错误检测和纠正，以及产品最终发布的授权。识别和实施适当的产品质量改进、过程改进、减少变异性、创新和药品质量体系增强，并提高持续满足质量需求的能力。质量风险管理有助于确定持续改进的领域并确定其优先顺序。
MSCs 产品的制造依赖于训练有素的员工，这些员工必须具备岗位要求。它是GMP质量体系的重要组成部分。中国GMP 的期望是参与生产和管理的各个方面的员工将有足够的教育、持续的培训和定期评估，以及履行职责的经验。负责岗位的人应该有具体的职责和足够的权力来履行职责。此外，《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（征求意见稿）的细胞治疗产品附录草案提出了更高和更详细的内容。对关键人员的资格要求，包括产品制造负责人、质量控制负责人和质量受权人。
MSCs产品的生产环境和设施的空气洁净度水平应与产品和生产操作相适应，生产环境和设施不应对原材料、中间体和成品造成污染。MSCs产品的生产环境和设施应易于有效清洁和消毒。此外，MSCs产品的制造环境和设施必须持续监控。此外，MSCs产品的制造环境和设施的清洁、消毒、维护和监控操作必须定期验证和持续控制。制造设备的设计、定位和维护应符合其预期目的和用途。制造、测量、称重、记录和控制设备应由适当的方法和合格的机构按规定的时间间隔进行维护、校准和检查。
CDE 主要通过申请人的文件系统获得GMP 合规性。这必须涉及运营和质量管理的所有方面，以便可以执行审计，跟踪与产品制造和质量控制相关的所有活动。此外，《药品良好生产规范（2010年修订）》指出，文件是质量保证体系的基本要素。制造商必须有书面的管理程序、质量标准、技术指南、生产处方和工艺规程、标准操作程序和内容正确的记录。企业应建立文件管理的管理和操作规程，系统地设计、制定、审查、批准和发布文件。质量管理部门应审查与本规范有关的文件。文件内容应与药品生产许可证和药品注册的相关要求一致，并有助于追溯每批产品的历史。
4.2 材料管理
材料是指用于制造MSCs产品的物质或材料，包括细胞、平衡盐溶液、蛋白酶、血清、培养基、细胞因子、各种添加剂、冻存试剂、转基因材料、赋形剂、培养瓶、细胞冻存袋、等等。制造材料直接关系到MSCs产品的质量。因此，材料管理必须建立在良好、规范的质量保证和评估体系之上，包括风险评估、关键材料制造商和供应商的资质审核、质量放行测试的开发和改进等。材料的来源、成分、用途、用量和质量控制应当明确、合理。在选择材料时，应考虑必要性、合理性和安全性，开展工艺去除效果验证和安全风险评估，必要时进行材料残留检测放行。使用已被批准用于人类或符合药典标准的材料非常重要。对于胎牛血清、人白蛋白等生物源性材料，应进行全面的外源性因素检测，并在技术开发中考虑对新的外源性因素的认识。产品自用应严格防止可能的外来因素传播风险。材料管理信息应在IND 申请的化学、制造和控制 (CMC) 部分提供，CDE审查员将确定其用于制造的适用性。
4.2.1 生物材料
用于间充质干细胞分离培养的生物材料均来自供者，并签署知情同意书，并经医院医学研究伦理委员会批准。对每个供体进行人类病原体筛查和测试。特别是对于人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的存在应该进行分析。培养扩增所需的所有起始材料和试剂都需要进行分析，以证明它们是无菌和无内毒素的。
细胞分离和培养扩增的程序应在GMP 条件下制定并验证建立主细胞库。在这些过程中需要实施质量控制，以确保储存在主细胞库（mast cell bank是笔误吗？）中的细胞已经过无菌、支原体和内毒素检测和监测。因此，制定明确的规格和要求，例如细胞表面标志物、优化的培养条件、细胞传代数、生长特性等。原则上，对于从生物材料中分离出来的适合建立主细胞库（maskcell bank是笔误吗？）的细胞，计划进行后续的细胞测试、保存和制造。细胞库的级别可根据细胞自身特性、生产状况和临床应用综合考虑；建立细胞库检验标准，检验符合安全性、质量可控性和/或有效性的基本要求。
4.2.2 辅料
必须验证其使用的必要性、安全性和合理性。建议选择批准用于人类的辅料。否则，需要进行全面的研究和评估。此外，在产品IND 申请过程中，最好选择关键辅料相关的审查和批准。
4.2.3 容器和封闭系统
为避免产品质量因储存而发生意外变化，制造商应完成安全评估和相容性研究MSCs产品制造过程中用于样品储存和/或成品的包装容器和密闭系统。为了说明其包装容器和封闭系统使用的合理性，还应完成气密性研究和冷冻储存适应性研究。MSCs产品的制造过程可能涉及样品与容器之间短期直接接触的步骤，例如作为收集的组织或细胞，在制备过程中的细胞，以及输液的成品。制造商应对接触容器系统与MSCs 产品进行安全评估和兼容性研究等。此外，建议在 IND 申请过程中申请直接接触容器和封闭系统相关的审查和批准。
4.3 GMP车间的CMC
由于细胞具有在体内存活、自主增殖或/和分化的能力，其临床研究和质量控制应充分考虑上述基本特征，而MSCs产品应满足药品质量管理的一般要求，临床样品的整个制造过程合理，符合《药品生产质量管理规范》的基本原则和相关要求。在制造过程和质量控制中应特别注意人员、环境、设备等要求。MSCs产品的制造应建立全过程或全生命周期的质量保证和控制体系；制造过程应进行严格的工艺验证，建立明确的关键控制点。对制造材料进行严格控制，建立并验证MSCs产品制造现场的标准操作程序，避免原材料和生产在制造过程中可能出现的外源污染或交叉污染。还应采取有效的隔离措施，防止混淆来自不同供体或不同预期产品的产品。
4.3.1 制造
MSCs 产品的制造过程是指从供体获得细胞到完成体外操作的过程。制造商必须进行工艺开发和验证，以证明工艺的可行性和稳健性。控制制造过程的每个步骤以确保成品符合包括规格在内的所有质量属性。过程验证被定义为从过程设计阶段到商业生产的数据的收集和评估，它建立了科学证据，表明一个过程能够始终如一地提供高质量的产品。工艺验证涉及在MSCs 产品和工艺的整个生命周期中发生的一系列活动。过程设计应该避免细胞发生非预期或不正常的变化，并满足消除相关杂质的要求。建立技术标准、工艺标准操作规程、关键工艺控制参数、内控指标和废品标准，对整个制造过程进行监控是十分必要的。制造商应继续优化制造工艺，减少物理、化学或生物效应对细胞特性的意外影响，并减少杂质，如蛋白酶、核酸酶和选择性抑制剂的使用。如果在制造过程中存在不连续生产，则应制定和验证细胞的储存条件和持续时间。建议采用封闭或半封闭的制备工艺，以降低污染和交叉污染的风险。
整个制造过程的监控包括关键过程参数（CPP）的监控和过程控制指标的实现。制造商应根据对整体工艺的了解和产品经验的积累，明确工艺控制中的关键制造步骤，制定敏感参数的有限范围，避免工艺漂移。必要时还可以对制造过程中的细胞进行质量控制。过程中的质量控制和细胞放行检测相结合，相辅相成，实现对整个过程和产品质量的控制。由于供体材料的变异性，可能含有传染病病原体，该过程可能导致MSCs产品的整个生产过程中应特别注意防止微生物污染。
间充质干细胞产品的剂型、处方及处方过程应根据临床用药需求和间充质干细胞产品的稳定性确定。部分MSCs产品在给药前需要经过产品成分物理状态的转变、容器的转换、过滤清洗、与其他结构材料的结合、药物剂量的调整等步骤。还应制定和验证这些工艺步骤的确定，并在实际产品制造和应用中严格执行。应提供有关制造MSC 所用组件和材料的制造信息，并总结在这些材料。应提供制造中使用的所有组件的清单。对于同种异体细胞，供体筛选和检测的信息应表明所有供体均符合供体标准。必须详细描述组织来源和MSCs的分离，大规模扩增和收集的培养。细胞库部分应提供有关历史、来源、来源和表征的信息，包括确定细胞安全性、身份、纯度和稳定性的测试。
4.3.2 产品测试和放行
MSCs 产品的质量研究应在整个开发和放大活动中从具有代表性的产品批次和适当的制造阶段样品中选择样品进行。质量研究应涵盖各种细胞分析，包括功能、纯度和安全性，可根据产品的特性和属性增加其他相关研究项目。制造商必须为MSCs 产品建立质量标准和质量控制策略。 MSCs产品应符合国家药监局批准的药品质量标准。国家药监局批准的药品质量标准为药品注册标准。药品注册标准应当符合现行《中国药典》的一般技术要求，不得低于现行《中国药典》的规定。申报注册品种的检验项目或指标不适用于现行《中国药典》的，生产企业应提供充分、合理的佐证资料。建议采用中间样品质量检验和最终产品放行检验相结合的机制。
MSCs 产品的分析程序和方法必须经过系统的验证和验证。申请人应提交分析程序和方法验证和验证数据，以支持MSCs 细胞库和 MSCs 产品的身份、强度、质量、纯度和效力的文件。对于预期目的，分析程序和方法的典型验证特性应考虑以下方面：准确度、精密度（包括重复性和中间精密度）、特异性、稳健性、检测限、定量限、线性和范围。分析报告应包括原理、设备、操作参数、试剂、参考标准和材料、验收标准、样品制备、稳定性、标准制备、测试程序、系统适用性、计算、数据分析和结论。MSCs产品生命周期内，如果原料药、生产工艺、法定分析程序、国家标准和自主研发的分析程序有任何关键变化，强烈建议重新验证。此外，当制造商提议用替代分析程序替代经过验证的分析程序或将分析程序从一个实验室转移到另一个实验室时，要求分析方法具有可比性。目前，分析程序验证的主要挑战是我国乃至世界范围内标准品和参比试剂严重短缺。因此，为解决标准参比试剂严重短缺的问题，MSCs产品生产厂家与标准参比试剂机构密切合作是十分必要和紧迫的。
随着研究的深入，应逐步积累工艺相关信息，改进分析程序，以满足各阶段的质量控制要求。质量控制一般应考虑身份（细胞形态、表型、细胞标志物等）、生物学功效、纯度、杂质、细胞数（活细胞数、功能细胞数等）、细胞生长活性、细胞周期、细胞倍增时间、克隆形成率和一般检测（如无菌、支原体、内毒素、端粒酶的表达和活性等）。细胞特性研究应以细胞类型为基础，包括细胞形态、细胞表面标志物、基因表达、细胞分化、表面标志物表达、效价测试、分泌组的定性和定量测定以及过程中添加的成分的残留量检测。
MSCs 产品功能研究的分析程序应根据细胞的性质、特性和预期用途建立。建立合理有效的生物药效分析程序，作用机制应与临床适应症相一致。在细胞纯度方面，建议测试细胞亚群和活力。杂质研究应包括细胞加工（如蛋白酶、动物血清蛋白、重组蛋白和细胞因子等）以及最终细胞产物（如死细胞残留物和其他可能的生物降解产物等）。安全性相关研究应根据细胞来源和过程的特点考虑，可针对外源性因素、细胞恶性转化的可能性、遗传稳定性、成瘤性和致瘤性进行选择。
细胞给药环节也需要设计和优化。如果需要在医院的研究中心进行操作（细胞回收、产品稀释等），申请者应建立规范的操作程序，并对临床研究人员进行良好的培训。强烈建议在给药前完成操作后进行标准化工艺验证测试，以验证最终产品的质量，如细胞形态、细胞表型、多向分化潜能、细胞数量和存活率、外观、效价、身份、无菌性、支原体、内毒素、其他外源性物质等。效力测量用于证明在临床研究的所有阶段和市场批准后，只有符合规定规格或接受标准的产品批次才被使用。一般来说，对于细胞和基因治疗产品，没有单一的测试可以充分测量那些预测临床疗效的产品属性。因此，有必要和建议开发几个属性测试来评估细胞和基因治疗产品的效力。应该对每个制造的产品批次进行放行测试。最终产品的规格应在IND 中明确设置，通常采用表格格式。最终释放测试数据最好在临床使用 MSCs 产品之前获得。从产品收集到管理，所有产品都必须是可追踪和可识别的，并带有适当的标签。
4.4 MSCs 产品的稳定性研究
MSCs 产品的生产推荐采用连续工艺。对于在生产过程中需要临时储存的样品，应进行稳定性研究以支持其储存条件和储存期限。必须进行稳定性测试以表明最终细胞产品在研究所需的时间内（从最终释放到给药）足够稳定，并且应指明最终产品的有效期。MSCs产品稳定性研究的基本原则可根据产品自身特点、临床用药需求以及贮藏、包装和运输条件，制定合理的研究方案。应使用具有代表性的细胞样品和储存条件进行研究。此外，还应制定和改进最终产品的运输方案，并对稳定性方案进行验证。此外，还应验证给药前的产品制备程序以确认最终产品的质量。
5 IND 申请中的药理学部分
IND 申请中提出的药理学部分必须支持拟议的临床试验。非临床项目的目标应该是确定拟议治疗产品的生物学合理性并确定生物活性剂量水平。
5.1 药效学
药效学研究应采用可靠的方法来验证MSCs 产品的基本治疗机制并确定生物效应标志物。试验设计应考虑对MSC产品的作用机制、疾病周期长短、给药程序等因素，并结合细胞在体内的特性和存活时间。建议使用相关的体外和体内模型完成MSCs产品的药效学研究。
5.2 药代动力学
药代动力学研究应该能够阐明细胞的体内过程和伴随的生物学行为。应根据MSCs产品的种类和特点选择合适的动物模型。一般来说，雌性和雄性动物都应该考虑。根据研究目的和指标的临床价值，建立合适的生物分析程序，并进行必要的分析验证。药代动力学研究应侧重于靶细胞的增殖、体内生物活性分子的表达和/或分泌，以及与宿主组织的相互作用。一般而言，药代动力学研究主要包括细胞的分布、迁移和归巢、细胞分化、凋亡、衰老等。
6 IND 申报中的毒理学部分
MSCs 产品的毒理学研究和评价应符合《药物非临床试验良好实验室规范（GLP）》。此外，对于在非GLP 条件下进行的某些研究，应解释和评估非 GLP 对试验结果的可靠性和完整性以及MSCs 产品整体安全性评价的影响。
6.1 安全药理学研究
活性物质间充质干细胞分泌的物质可能对我们身体的多个系统产生影响，包括中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统等。间充质干细胞产品也可能影响重要器官功能。因此，安全药理学测试可以识别可能与人类安全相关的因素的不良药效学特性，对MSC是必要的。此外，如果在毒性试验中发现潜在风险，应补充相关的安全药理试验进行进一步评估。
6.2 单剂量毒性试验
单剂量毒性试验可以获得剂量与全身或局部的剂量反应关系。毒性，有助于了解毒性作用的靶器官，也可为重复给药毒性试验的剂量设计提供一定的参考。由于MSCs 产品可以发挥或诱导长期作用，因此单次给药的观察时间应考虑细胞的存活时间，一般应比常规的单次给药毒性试验观察时间长。目前，对于MSCs单次给药毒性试验观察期为1个月。
6.3 重复给药毒性研究
试验设计应包括常规毒理学研究的基本要素，并结合MSCs产品的特殊性，以获得尽可能多的安全信息。根据MSCs产品的不同特性，采用能产生MSCs产品生物活性的动物物种进行重复给药毒性研究。如果可以在没有相关物种的情况下进行非临床研究，那么对非相关物种的动物实验也可能对评估制造过程、全处方的安全性和非目标效应有价值。参照《重复用药毒性研究技术指南》，需要设计多个剂量水平，包括临床建议剂量范围和最大可行剂量，以及处方组成和制造工艺。除常规观察指标外，还应根据产品特性如行为检测、神经功能检测、心功能评价、异位增生病变（如肿瘤）、生物标志物、活性分子分泌、抗间充质干细胞抗体水平、免疫反应，以及与宿主组织的相互作用。关于重复给药毒性试验的持续时间，ICH指南建议啮齿动物模型为 6 个月，非啮齿动物模型为9 个月。
6.4 免疫原性和免疫毒性研究
MSCs 产品需要进行研究了它们的潜在免疫原性。免疫原性研究请参考最新版技术研究指南。此外，应注意间充质干细胞产品的免疫毒性。
6.5 成瘤性/致癌性研究
MSCs 产品的成瘤性/致癌性风险取决于细胞的分化状态、生产过程中使用的细胞培养程序引起的生长动力学变化、诱导或增强宿主和靶标形成肿瘤的可能性患者人群等，需要根据上述特点综合考虑。目前，如何选择动物模型进行成瘤性/致癌性研究尚无科学共识。成瘤性/致癌性研究应使用临床预期产品进行测试。成瘤性/致癌性研究需要确保细胞能够在体内长期存活，以考察是否存在潜在的肿瘤形成。实验设计应仔细考虑以下几个方面：(a) 合适的对照组（如阳性对照、空白对照），此外，建议有 3 个不同的MSCs 细胞剂量组； (b) 每组必须有足够的动物，使肿瘤发病率分析符合统计要求，建议每组20只小鼠； (c) 需要包括最大可行剂量，建议最高组的剂量超过临床建议剂量的10倍；(d) 受试物应到达计划的临床治疗部位，并应考虑皮下和临床给药途径； (e) 一个足够长的测试周期，一般建议为6 个月。此外，由于免疫排斥，人源性 MSCs 产品的成瘤性/致癌性研究可以考虑使用免疫缺陷啮齿动物模型NOD/SCID、NPG、NSG、NOG等。
6.6 生殖毒性研究
评价间充质干细胞产品的生殖发育毒性主要取决于间充质干细胞产品的特性、临床适应症和临床使用的人群，应根据具体情况进行详细分析。
6.7 遗传毒性研究
对于人源性MSCs产品，如果产品与 DNA 或其他遗传物质有直接相互作用，需要进行基因毒性试验。
6.8 特殊安全性研究
根据MSCs 产品的特性和临床应用，评估局部耐受性、组织相容性和耐受性还应考虑分泌物质。
7 IND临床试验注意事项
当MSCs产品进入临床试验阶段时，研究人员应遵循《药物临床试验良好临床规范（GCP）》、《人源干细胞及其衍生细胞临床试验技术指南的要求治疗产品（征求意见稿）》（2020年7月，国家药监局CDE生物制品临床部发布），ICH协调三方良好临床实践指南（E6-R1）。临床试验内容原则上应包括临床安全性评价、药代动力学、药效学、剂量探索和验证性临床试验。此外，具体的临床研究设计可以根据不同MSCs 产品的性质调整为选定的指标。
7.1 指标选择
MSCs 产品的治疗潜力来自其几个特性，包括（a）分化成各种细胞谱系的能力，(b)分泌对生存和增殖至关重要的可溶性因子，(c) 调节免疫反应，以及(d) 迁移到损伤部位。MSCs 的特性是选择指标的主要考虑因素。此外，研究者通常根据体外和动物模型药效学选择合适的指标。此外，论文中报告的、在临床试验机构注册的、经某些药物评价中心批准的指标也被推荐作为新指标选择的参考。
7.2 受试者保护
受试者选择过程的目的是确保仔细评估研究受试者的预期风险和潜在收益，同时实现研究的科学目的。对于具有长效或永久效应、侵入性给药等高风险特征的MSCs产品，应选择有望从治疗中获益的患者进行试验。受试者的选择可能会影响临床试验的风险和收益。临床试验建议书和知情同意书应充分说明受试者可能的风险和获益。
7.3 药效学
在早期临床试验中，主要目的通常是评价产品的安全性，次要目的是初步评价产品的疗效，即药效学评价。评估指标是可能表明潜在有效性的短期影响或长期结果。在MSCs产品的活性评价中，可以包括基因表达、细胞植入、形态变化等生物标志物等特殊指标。它还可以包括免疫功能的变化或各种类型的生理反应。如果使用MSCs 产品的目的是纠正功能缺陷或受损细胞或组织的生物学功能，则应进行 MSCs 产品的功能测试。如果MSCs 产品的预期用途是修复/免疫/替换细胞/组织并有望终生发挥作用，则应将相关的结构/组织学测试指标作为潜在的药效学标志物进行测试，包括显微镜检查、组织学测试、成像技术或酶活性指标检测等。
7.4 药代动力学
MSCs 产品的体内过程研究应尽可能开展。在临床试验中，应讨论研究要求、可能的方法和可行性，并应注意MSCs产物预期活性过程中细胞活力、增殖和分化能力、体内分布/迁移及相关生物学的检测。如果需要多次给药MSCs 产品，则在设计临床方案时应考虑 MSCs 产品在体内的预期存活时间和相应的功能。然而，由于方法学的限制，实际上很难实施药代动力学。
7.5 剂量探索
早期临床试验的目的之一是探索MSCs产品的有效剂量范围。如果可能，还应确定最大耐受剂量。MSCs产品的用量应根据产品质量控制研究和非临床研究的结果确定，并综合考虑产品的生物学功效。部分MSCs产品将长期存在于课题中。因此，首次人体试验应采用单剂量方案。在充分考虑对产品毒性和作用持续时间的了解后，可以进行重复给药临床试验。剂量增加的设定应考虑临床前数据和任何现有临床数据中与剂量变化相关的风险和活动。同时，应充分考虑MSCs产品的特定安全风险，并设置足够的给药间隔和随访时间，以观察急性和亚急性不良事件。虽然MSCs 产品的剂量可能取决于患者的个体情况，但早期临床试验提供的剂量探索研究证据仍然是确证性临床试验中确定剂量的重要依据。
7.6 临床疗效
通常，确证临床试验应在目标适应症人群中进行，应有足够的样本量、合理的控制、有临床意义的终点指标的选择以及详细解决这些指标的统计方法。并且必须确定终点测量的方法。统计学家应计算以足够的统计能力回答问题所需的适当样本量。此外，临床试验应能够提供一种临床给药方案，能够在目标人群中产生预期的治疗效果、疗效持续时间以及获益和风险。以前经过验证或普遍认可的指标可作为替代终点，应具有临床意义并与治疗的疗效相关。如果MSCs 产品的疗效依赖于输入细胞生物活性的长期维持，临床试验观察时间应根据 MSCs 产品的预期生物活性设计，并制定长期的患者随访计划29,47
7.7 临床安全性
MSCs产品的安全性监测应贯穿产品开发的全过程。所有在非临床研究中出现的安全问题都应进行分析并提出解决方案，尤其是在缺乏相应的动物模型或缺乏同源动物模型来预测人与动物在生理差异背景下的安全性的情况下。在早期试验中，其主要目的是评估安全性。基于风险考虑，在第一个受试者的安全性得到充分暴露和评估后，应逐案纳入其他受试者。安全性评价的一般监测通常包括症状记录和常规临床检查。具体监测项目取决于多种因素，如MSCs产品的性质及其机制作用、研究人群、动物研究结果以及任何相关的临床试验经验，包括发表论文。除了对预期和意外安全问题进行一般检查和监控外，还需要评估MSCs 产品的特定预期安全问题。如急性或延迟输液反应、细胞因子释放综合征、自身免疫反应、移植失败或MSCs产物失活、移植物抗宿主反应、相关恶性疾病、供体传染病的传播等。此外，申请人必须收集临床试验中的所有不良事件，并按照ICHE2A和和 ICH E2B(R3)的要求向CDE报告。
在MSCs产品的确认性临床试验和上市后阶段，除了一般症状记录和常规临床检查外，还应注意一些重要生物学过程的变化，包括免疫反应、免疫原性、感染、恶性转化等。由于MSCs 产品的药理活性可能缓慢或延迟，因此无论受试者是否接受了整个治疗计划，都应持续监测其安全性和药理活性。对于预期具有长期活性的产品，应跟踪患者确定长期疗效，充分暴露与MSCs产品相关的安全问题。随访的持续时间应能够提供有效性的初步证据和MSCs产品活动的持续时间，并应考虑产品是否引起迟发性安全问题等因素。基于风险管理，建议对重复给药产品进行临床安全性研究。在确定最大安全剂量时应考虑重复给药的可能性。在MSCs产品的临床试验中，不良反应的发生频率或严重程度存在相当大的不确定性。因此，临床试验计划应包括停止标准、风险评估计划以及独立的数据和安全监测委员会。
7.8试验停止规则
NMPA建议 MSCs 产品的临床试验计划应包括试验停止规则，以便风险和可以随时控制受试者的数量。试验停止规则通常规定事件的严重性或频率（例如与适应症或给药方式相关的特定医疗事件或死亡）。在评估情况之前，将暂停招生和管理。根据评估结果，临床试验方案可能会被修改，以降低受试者的安全风险。修改一般包括修改入组标准（如排除特定不良事件风险较高的受试者），或减少剂量和次数，调整产品配方或给药方式，或改进受试者安全监控程序。试验计划调整完善后，可恢复试验。
7.9 风险管理计划
制定风险管理计划时，应详细说明常规药物警戒和产品可追溯性。此外，还应综合考虑给药方式、个体化制剂、特殊治疗或辅助治疗等可能导致MSCs产品疗效和安全性差异的差异。作为风险管理的一部分，应制定标准化和可行的标准操作程序，临床研究人员应接受系统培训并通过评估。MSCs产品可能需要特定的长期研究来监测特定的安全问题，包括失败。应评估感染、免疫原性/免疫抑制和恶性转化等长期安全性问题。并且需要足够的随访时间来评估MSCs产品的安全性。作为高风险的间充质干细胞产品，患者应在早期进行足够长的随访，甚至终生随访。临床晚期可根据MSCs 产品应用经验的增加，延长或缩短随访时间。
8 IND 前会议
强烈建议与CDE举行IND 前会议，以讨论包括MSCs产品在内的任何创新药物。 pre-IND会议为II型会议，在提交首次临床试验申请前解决重大技术问题。技术问题主要包括现有研究数据是否支持拟进行的临床试验、临床试验受试者的风险是否可控等。会议要求应提交足够的信息，包括临床试验提案、药物和非临床研究信息。申请人应通过药品审评中心网站“申请人窗口”编制并提交合格的“交流会申请表”和“交流会材料”，并在申请时注明交流方式。沟通形式包括：面对面会议、视频会议、电话会议或书面答复。并鼓励申请人通过电话会议与药物评价中心进行沟通。然而，作者建议面对面的会议沟通是创新药物最有效的选择。CDE 将决定通信申请是否符合要求以及申请人提交的通信形式。 CDE 通常会在收到沟通会议申请后60 天内批准召开一次 pre-IND 会议。当问题集中且具体时，会议通常最有成效。问题应尽可能准确，包括前言和背景，并简要说明问题的背景和目的。应尽可能避免公开的和新的问题。通常，IND前会议安排为 60 分钟，偶尔为90 分钟。会议纪要应按照“沟通和交流会议纪要模板”的要求编写。申请人与CDE达成协议的，应当陈述共同意见。如申请人与CDE未达成一致意见，应说明各自的意见，作者建议申请人应尽快制定以下计划和方案，并征得CDE同意，对不同意见作出回应。会议记录应不迟于会议结束后30 天定稿。鼓励现场形成会议纪要。会议纪要在定稿后2日内由CDE项目管理人员上传至通讯系统，申请人可通过申请人窗口查看。会议纪要主要包括共识和分歧两部分，并作为重要文件存档。
9 IND 提交
IND 申请的提交将在IND 前会议和签署的会议记录之后进行。同时，申请人必须充分解决在IND 前会议上提出的任何问题才能成功。自2018 年 2 月起，细胞治疗产品应按照人用药品注册通用技术文件的组织指导文件进行备案。收到IND 申请后，CDE 有5 天的时间检查提交材料的完整性根据生物制品注册受理审查指南（II类治疗性生物制品，征求意见稿）决定是否受理IND申请。CDE授予一个受理号，受理后向申请人发出受理通知IND 申请。 IND接受后，CDE将进行专业评审和评估。
10 CDE对IND申请的行动
受理IND申请后，CDE将组织药学、药理、毒理、医学等技术人员对IND申请材料进行审查和评价。审稿人可能有问题，提供非保留意见，或在60 天期限内将 IND 置于临床保留状态。通常，CDE会提出意见和/或问题，并会在60 天截止日期之前联系申请人。此时回复该机构将有助于申请在 60 天的时间内完成。申请人应在5 天内全面回答这些问题。CDE 可以申请临床暂停以阻止临床调查继续进行，直到确定的问题得到全面解决。IND中的几个关键部分是临床方案，其中包括受试者的适当资格、纳入和排除标准、调查终点、随访周期、停止规则和给药理由（开始剂量/剂量递增）、给药频率和时间表、过程和资格研究，以及安全性、药理学和毒理学研究。持有临床试验申请的，申请人在完成补充研究后，可通过重新提交注册IND申请材料的方式申请临床试验。
11 进行临床试验
临床试验是MSCs产品开发的最后一步，但并非最不重要的一步。 MSCs治疗的安全性和有效性必须在临床试验中得到验证和符合。当IND 生效时，研究人员和临床医生可以根据 CDE 批准的试验建议进行临床试验。申请人在开展后续临床试验前应制定相应的临床试验计划，经伦理委员会审查批准后进行，并提交相应的临床试验计划和支持资料。申请人应定期在CDE 网站上提交试验期间的安全更新报告。试验期间的安全更新报告应每年提交一次，并在每 1 年获批后的2 个月内提交。对于临床试验过程中可疑、意外的严重不良反应和其他潜在的严重安全风险信息，申请人应当按照相关要求及时向CDE报告。
12 未来展望
MSCs从研发阶段向治疗应用的转化在临床上通过监管机构的要求很高。了解监管问题的总体路径有助于为IND 申请中所需数据的生成和编译建立一个清晰的框架。在中国，建议尽早与 CDE 沟通。在法规中制造一致、有效的MSC 产品是一项具有挑战性的工作。 MSC用于疾病干预的固有特征是它们是活细胞。此外，在临床试验中进行的MSCs 的异质群体可能会导致不同的结果。制造工艺的优化以及效力测定的开发和验证可能需要很长时间。此外，生物变异性、原材料标准、表征、试剂、无菌处理和冷冻保存对于开发过程中的检查都是必不可少的。相关MOA 的识别对于确定异质性程度的可接受性至关重要，因为特定临床应用中的 MSC 活性应有助于选择理想的MSC 群体，无论这可能是定义的异质制剂还是特定的子集.目前开发的大多数MSCs 候选产品都是在各种协议下扩展的异质群体。因此，MSC 产品可以从体外（细胞和生化）和体内（动物和临床）研究中产生各种特征。产品需要确保满足标签要求并符合适用的生物制品和cGMP 法规。 CDE 要求提交在所有阶段临床研究中使用的产品数据，以确保质量、身份、纯度、强度和稳定性。这对于效力测定开发非常重要，因为它与治疗剂量和产品功效相关。效力测定可测量MSC 产品的生物活性，并验证不同批次产品或不同 MSC 产品之间的可比性。效力测定数据需要证明与提议的临床应用的生物学相关性。如果无法进行效力测定，如果已证明与功能相关，则可以考虑进行替代测试，例如转录组和分泌组分析。FDA 发布了一份指导文件，建议开发细胞和基因治疗产品的效力测定。在提交 IND 申请之前，需要完成许多关键的转化步骤，包括工艺开发和改进、分析程序开发和验证、GMP合规性车间建立与验证、质量风险评价与管理、药品质量体系建设与实施等。所有这些开发步骤相互关联，对于MSCs 产品过渡到临床试验非常关键。因此，MSCs产品开发和IND应用是一个漫长而复杂的过程。一般来说，MSCs产品的IND申请流程包括产品制备、质量检测、质量管理等合规流程。MSCs产品开发的科学性主要是通过药物发现阶段的基础研究来解决，而MSCs产品的合规性开发主要是针对国家和NMPA对产品开发过程的参考法规和指导方针。从MSC 治疗公司的角度来看，早期的监管策略发展是可取的。在整个 MSC 产品开发过程中，与监管机构密切沟通和合作将使监管途径变得简单明了。
图1：间充质干/基质细胞（MSCs）产品开发内容及流程图。工艺开发、配方选择、工艺验证、分析方法开发和验证、不同的释放和稳定性规范、非临床研究、研究性新药（IND）申请、I期、II期、III期、新药申请（NDA）和商业化. CMC、化学、制造和控制
Development and investigational new drug applicationof mesenchymal stem/stromal cells products in China
doi.org/10.1002/sctm.21-0083
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