miRNA的一般研究策略

miRNA也称微RNA、microRNA，是真核生物中广泛存在的一种长度为21-23nt的RNA分子，可通过与mRNA的结合，抑制mRNA的转录，因此在基因表达调控、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。

图1 miRNA的一般研究策略及相关实验手段

 

1 生物信息学预测靶基因

要对miRNA进行研究，首先需要采用生物信息学的方法预测miRNA的靶基因位点，即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA和rna22 algorithms。

 

2 靶基因的预测结果确认

进行靶位点预测之后，接着是要通过miRNA pulldown方法，识别靶基因位点。其中，有以下三种常用的pull-down方法：

（1）生物素化的miRNA pull-down（biotinylated miRNA pull-down）。通过生物素标记的合成miRNA转染细胞，孵育后裂解细胞，用链霉亲和素包被磁珠吸附筛选miRNA及其作用的mRNA。

图2 生物素化的miRNA pull-down

（2）标记的miRNA pull-down（labeled microRNA pull-down assay，LAMP），通过用地高辛（DIG）标记的pre-miRNA寡核苷酸与细胞提取物混合孵育，用抗地高辛的抗体做免疫共沉淀（IP），获得被共沉淀的mRNA。

（3）核蛋白免疫共沉淀-RNA高通量测序（Ribonucleoprotein immunoprecipitation followed by microarray chip analysis，RIP-Chip，RIP-seq），通过用合成的miRNA转染细胞，孵育后裂解细胞，用特异的抗AGO2抗体对RISC进行免疫共沉淀，对获得的mRNA进行microarray分析。

 

图3 RIP-Chip基本实验流程

  

3 miRNA的直接功能确认

通过实验方法验证miRNA是否能特异结合靶mRNA并特异抑制其表达。

（1）3’-UTR reporter assay

通过在报告基因如荧光素酶CDS的下游3’-UTR区域插入待确认的目的基因，克隆到载体如psiCHECK-2上，载体转染细胞，再用miRNA进行处理，如果目的基因上含有靶位点，则荧光素酶的转录受到抑制不发荧光。

 

图4  3’-UTR报告基因基本实验流程

图5  3’-UTR报告基因验证miRNA直接作用情况

（2）miRNA的上调与下调

通过人工合成miRNA模拟物（miRNA mimics）或miRNA抑制物（miRNA inhibitor），增强或抑制miRNA的抑制效果，并与对照相比。

 

图6 miRNA的上调与下调验证miRNA直接作用情况

 

（3）位点定向突变（site-directed mutagenesis）

首先，将待测基因反转录为cDNA，通过用致突变的引物对cDNA模板进行重叠PCR扩增；然后，用相关的酶（一般为Kinase-Ligase-DpnI）对cDNA模板进行消化，克隆到报告基因载体；最后，将构建好的克隆转染至细胞，检测报告基因的表达。若表达显著下降，可表明靶位点定位准确。

图7 位点定向突变基本实验流程

 

4 miRNA的整体功能验证

对miRNA的上调/下调，通过Western Blot或其他生物学通路分析实验，探究miRNA最终是如何影响细胞、疾病等等情况。

 

5 miRNA的定量和定位

通过RT-qPCR、原位杂交（in situ hybridization）、microarray等实验手段，确定miRNA的具体表达量及其所在位置，以明确补充其机理研究。