microRNA（miRNA）是生理和疾病中调控基因表达的关键因子，通过抑制mRNA翻译或促进降解介导靶基因的翻译抑制。miRNA翻译抑制的功能在过去的很多年被广泛研究，但miRNA自身的转录调控机制却缺乏有效的研究，其难点是miRNA启动子难以捕获。
miRNA启动子难以捕获？？？启动子不就是紧挨着转录起始位点（TSS）嘛，为什么说启动子难以捕获呢？小编见证了太多的科研者获取miRNA启动子时，直接延伸上游2k，这样对吗？
lncRNA、mRNA等分子获取启动子时，直接取TSS上游序列即为启动子，但此操作不适用miRNA，这要从miRNA的形成机制说起：前体pri-miRNA在基因组上转录，在细胞核进行第一次剪切，形成第二个前体pre-miRNA（长约70~120nt），pre转移至胞浆进行第二次剪切，形成成熟体Mature，也就是功能性的miRNA（长约20nt）。目前数据库只收录了pre以及Mature，而没有pri，但实际pri 5’端的第一个碱基才是TSS，由于pri未知，这就让miRNA启动子的获取变得困难，而直接取pre上游序列作为启动子肯定是不对的。
图1. miRNA的形成机制
由于初级前体pri不稳定，且每个miRNA的pri长度都不一样，更有甚者，同个miRNA在不同细胞系的pri长度都不同（pri前体的长度为几百至几千bp，小部分pri-miRNA能超过10 kb），且受限于技术及成本，所以目前数据库是未收录pri完整序列。
日本科学家通过保守性及TRANSFAC权重矩阵推定了79个人miRNA的启动子（miPPR），得出miPPR位置与相应miRNA之间的中位距离估计为5.5 kb的结论2：
表1（展示部分结果）
a,染色体位置；b，启动子长度；c，启动子与miRNA的距离
表2. 含有超长前体的pri-miRNA1
那要获取miRNA的启动子该如何操作呢？完全束手无策了吗？别急，且看下文：
一、RACE实验获得准确的
pri-miRNA前体序列
要想准确获得miRNA启动子，必须确定前体pri的序列，至少是5'端序列。因此，RACE实验是不二的选择。通过已知的pre设计引物，进行cDNA末端克隆，获得5'末端序列，此为TSS位点，TSS上游即为启动子序列。Science的一篇文献，通过RACE技术，成功扩增了多个果蝇pri（mir-276a，mir-277和mir-8）的5'端和3'端，并且还鉴定出pri-miR-276a和pri-miR-277有两个TSS3：
图2.RACE鉴定的果蝇三个pri-miRNA及其TSS位点
并且通过启动子截断构建荧光素酶报告系统，验证了miR-276a的TSS2活性更高：
图3.启动子截断实验：P3,TSS1的- 487至+ 791；P4,TSS2的-239至+ 49；P5,TSS下游序列，验证此区域有无启动子；Empty,空载
二、基于miRNA位置、算法的分析
虽然RACE是最严谨的做法，但不是每个科研工作者都有条件操作，那么可以根据miRNA位置，并结合一些预测类型的数据库进行分析、判断、验证。miRNA在基因座上存在三种位置情况：基因间（intergenic）、内含子内（intronic）、宿主基因内（host gene），miRNA位置信息可在NCBI-GENE（点击进入）主页的“Genomic context”及“Genomic regions, transcripts, and products”图中获得。PROmiRNA基于DeepCAGE数据，预测了7244个miRNA TSS，并标注了与miRNA的距离，发现基因间的pir前体长度较为分散，而其余两种pir前体长度大部分都较短4： 图4.三种位置的miRNA与TSS距离的分布
基因间（intergenic）、内含子内（intronic）、宿主基因内（host gene）三种位置的miRNA启动子获取方式如下：
1. intronic-miRNA
miRNA位于基因（一般指mRNA）内含子的情况比较复杂，miRNA可能有自己独立的启动子，也可能来源宿主基因的内含子剪切产生miRNA，也就是miRNA跟宿主基因共用启动子。
Fatih Ozsolak等人利用核小体定位和染色质特征鉴定了175个人类miRNA的近端启动子，观察到三分之一的内含子miRNA具有独立于宿主的启动子，独立启动子TSS到miRNA的距离最短，平均为4.2 kb±3.5 kb；而使用宿主基因启动子的TSS距离miRNA距离要远得多，中位57 kb。这些结果表明，远离其宿主TSS的某些内含子miRNA可能已经进化为采用附近的独立新颖TSS，以使pri-miRNA的转录更快，更有效5。
图5.内含子miRNA与宿主TSS距离及
是否用宿主启动子的占比
根据mRNA-miRNA表达谱实验，与依赖宿主基因的miRNA相比，具有独立启动子的miRNA与宿主基因表达的正相关性较低（红色），而依赖宿主启动子的miRNA与宿主基因表达相关性较高（灰色）：
图6.内含子miRNA独立/非独立表达与宿主表达的相关性
根据以上研究结果，对于定位于基因内含子的miRNA，可以先验证宿主基因与miRNA表达水平是否相关，再结合miRNA距离宿主TSS的距离，判断miRNA是否独立转录。
2. host gene-miRNA
不同于mRNA的intronic-miRNA,一些miRNA直接由lncRNA的外显子或者内含子生成，这类lncRNA在命名时，直接命名为对应miRNA的HG（host gene），如MIR155HG（MIR155 host gene，Gene ID: 114614）、MIR17HG（miR-17-92a-1 cluster host gene，Gene ID: 407975），这类在数据库已经鉴定出lncRNA为miRNA宿主基因的，表明miRNA产生来源宿主，直接取宿主启动子即可，是三种情况最简单、最准确的。
图7.内含子中的miRNA
喉鳞状细胞癌的发生与MIR155HG相关，而进一步的实验证明，是miR-155-5p的上调导致了细胞增殖，而不是lncRNA-MIR155HG，这表明，宿主lncRNA主要作用是产生miRNA，而非自身发挥功能6。
图8.C,宿主lncRNA上调导致细胞增殖增加；D,miRNA增加、抑制分别导致细胞增殖增加、减少
3. intergenic-miRNA
基因间的miRNA，由于不存在宿主，所以一定有自身启动子。前面论述过该类型miRNA与TSS的距离跨度较大，对于寻找启动子，难度偏大。
图9.位于基因间的mir-124-3
目前预测miRNA启动子的方法不外乎基于启动子保守性、组蛋白H3K4me3和DHS标记、TATA盒预测等方法。小编推荐三个网站分析（当然也是用）：
1. 懂生信的可以借助PROmiRNA（基于CpG含量，保守性和TATA盒亲和力的算法）分析; 2. mirtrans 基于组蛋白修饰、启动子预测等算法预测miRNA启动子。使用网站时，直接输入miRNA的名称，预测TSS位置，如查询has-mir-17，网站给出了不同细胞系的起始位点不一致，并预测了转录因子，十分实用（对于TSS位点大于10k的，请谨慎参考）： 图10. mirtrans预测的miRNA与TSS的距离
3. 基于大部分pri前体在10k以内，则取pre上游5~10kb进行启动子分析，找出可能存在的启动子位置，再进行验证（点此）。小编输入人源MIR-183上游5k，分析出三个预测的启动子，其中距离pre 1400bp=(5000-3600)的位置启动子可能性最高。 图11.cbs预测的启动子位置
而后，结合图三进行启动子截断，构建不同长度的启动子区段，通过双荧光素酶验证启动子具体座落位置即可。
以上就是小编结合多篇文献总结的miRNA启动子特征以及验证方法。总结下，要研究miRNA的启动子，尽量先查询文献，看看有没有该启动子的报道，如果没有，有条件的做RACE实验，没条件的，结合miRNA位置，以及预测类的网站，多构建一些pre前体上游序列，并进行截断验证。总之，miRNA启动子研究没有捷径，吉凯基因可为您分析、设计一站式助力，赶快来咨询吧！！！
【参考文献】
本站仅提供存储服务，所有内容均由用户发布，如发现有害或侵权内容，请
点击举报。
