师兄 & 师姐 & 师傅曰（shuo）
如果你选择科研这条路
必要耐得住乏味与寂寞
白天做实验，晚上写论文
吃饭看文献，走路思课题
忙碌一整年，毕业仍无期
今天就来跟大家来聊聊，虐我千百遍我却依旧没初恋的「病毒载体包装」技术。
所谓的「病毒」可以说其是一种优秀的基因传输载体，也一直是科学家们研究的热点。它利用病毒具有传递基因组进入其他细胞的特性，进行感染。病毒可用于体内或细胞培养中的基因递送，在基础研究、基因疗法或疫苗中都有极高的应用价值。
病毒载体包装过程是复杂的，在实验中常常会遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功。有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒?
病毒载体的选择：
慢病毒 or 腺相关病毒（AAV）？
慢病毒
高效的转染，可插入细胞基因组，持续时间长， 包装周期短（一般两个月）；
表达稳定，可遗传，包装基因整合到基因组 DNA 上，高水平表达，低变异；
不干扰细胞， 细胞功能不受侵染过程影响；
生物安全， 四质粒系统包装最大的安全性，非人源 FIV 病毒最大限度降低风险。
慢病毒纯化后梯度稀释观察
腺相关病毒（AAV）
安全性高，极低基因组整合概率；
极低免疫原性，外源基因不涉及原癌基因、有毒基因的载体；
长效转导，至今录有最长的灵长类肌肉内表达时间有 10 年以上；
多样的组织倾向性，目前文献中已经存在数千的突变型血清，具有极广的可选择性。
AAV 感染观察效果
慢病毒 、腺相关病毒（AAV）区别对比
10+ 年经验分享
「病毒包装」心路历程
为了让大家在病毒包装这块少走弯路，莱德盟生物资深技术大咖通过多年实验服务项目的纵深，针对不同载体系统病毒包装进行全方位的经验总结与心得分享，主要以下几个方面：
一、病毒包装的关键点
病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统（尽量使用成熟的商业化载体系统）、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制（24、48 小时的细胞及荧光状态判断）、目的基因对病毒包装影响（基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功）。
二、病毒感染效率
病毒感染效率主要和三方面有关，病毒本身的滴度，目的细胞种类以及个人操作问题。在这里先把操作问题排除，若想提高病毒感染效率，可以先提高病毒滴度，在感染的过程中适当的加大病毒感染量或者通过多次加入病毒提高感染率。
其次，也可以加一些辅助感染试剂来提高病毒感染率的，如 polybrene。另外，你要根据不同的目的细胞加入合适的病毒量，这样才能更精确的提高病毒感染效率。
三、病毒浓缩
病毒一般可以收两次，可以在 48 h 和 72 h 各收一次。如果你不想麻烦浓缩病毒的话，也可以不浓缩，直接将收集的病毒上清作为要感染的细胞的培养基，但是可能效果会不太好。并且一般收病毒时，培养基的营养已经损耗了很多，那样直接培养感染细胞会损害细胞，所以建议还是进行浓缩后再感染。
如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验，细胞因素应该没有什么问题（细胞培养人员一定要关注，包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否）。
细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节（正常包装出病毒情况，慢病毒、逆转录病毒包装一个细胞出一个病毒颗粒，腺病毒是 1,000 个，腺相关病毒是 10,000 个），所以实践操作表明，病毒包装转染时细胞的密度要控制，使得收毒（72 小时）时细胞密度在 90~95% 左右。
四、建议使用商品化的成熟毒载体系统
尽量不要用来路不清或基本被淘汰很少人在使用的系统，从文献和我们多年的实践可以结论，这类系统是稳定的，因而分析原因时尽量少花精力在对载体系统的验证上，这样会白花力气。
五、操作控制细节规范严谨
至于包装转染时的操作控制细节及其转染试剂因素，只要在操作时按相关使用说明和操作步骤，应该没有大问题，所以也不要白花太多精力在这上面。
六、排查构建缺失或污染因素
重点关注和排查的因素就是目的基因的表达载体构建和抽提纯化环节，是否构建时导致质粒载体重组或某个部件缺失，或污染别的质粒或杂物中抽提纯化是否污染? 是否抽提的是别的质粒?
要养成同时做阴性对照的习惯（是否目的基因载体和阴性对照 GFP 载体是同一批，建议同一批，建议每次包装都如此操作），如果这个环节没有啥问题，在构建中出现重组和缺失、或抽提纯化失败的可能性也不大。
七、概率极低最后的尝试
落实了上面那些因素，那就是最后一个原因。目的基因的大小、序列情况、该目的蛋白的功能毒性等导致无法包装成功（实践中，这种情况是有的，我们偶尔会遇到，可能原因是一些基因表达翻译后对包装细胞产生毒性，导致细胞状态异常）。
那么我们能做的就是换病毒包装载体系统，尝试其他载体系统能否包装出来。不过这种情况出现的几率非常低，你做上 100 个基因，也可能碰不上一个。
因而总的来说，我们进行病毒包装实验时要重视包装材料——细胞及表达质粒（对拿过来的细胞和载体系统要验证，常出现包装细胞、空表达载体质粒就有问题，我们要定期纯化生产包装细胞、空表达载体质粒）。
细胞培养时让它「白白胖胖、活力充沛」，目的基因的表达载体构建纯化良好，质粒间比例得当，病毒包装实验还是能有较好的结果。
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文章来源：莱德盟
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