作 者：田超，吴钦超，褚现明
作者单位：青岛,青岛大学附属医院心内科; 青岛大学附属心血管病医院心内科
基金项目：国家自然科学基金资助项目(82172574，81871231); 山东省高等医学教育研究中心科研规划课题项目(YJKT202171)；中华中医药学会课题项目（2021HH-006）；山东省中医药科技项目（2021M164）
通信作者：褚现明,E-mail: chuxianming@qdu.edu.cn
摘 要
阿霉素被广泛用于血液和实体肿瘤的化疗，大大延长了癌症患者的生存期。但与此同时，阿霉素在非癌组织中的蓄积亦可造成“脱靶效应”，即化疗毒副反应，其中以阿霉素心脏毒性最为显著和致命，而目前缺乏阿霉素心脏毒性的有效诊疗手段。近年来，外泌体研究方兴未艾，异质性、稳定性和免疫原性低等优点使其成为众多疾病的良好诊断标志物和治疗载体。本文主要对外泌体中非编码RNA诊治阿霉素心脏毒性的相关研究进行述评。
阿霉素是一种细胞周期非特异性蒽环类化疗药物，通过抑制DNA的转录和复制、提高细胞内氧化应激水平杀伤肿瘤细胞，但是这种杀伤效应具有非选择性。由于阿霉素的心肌亲和力，其对心脏产生的毒副作用尤为明显。目前，研究人员认为阿霉素心脏毒性（doxorubicin-induced cardiotoxicity, DIC）产生的原因主要与心肌细胞内氧化应激水平升高及其引起的心肌细胞受损和死亡有关，但具体机制仍然不清楚，亦缺乏有效的DIC早期检测手段。临床医师通常在癌症患者化疗时预防性给予心脏保护剂，如右丙亚胺和维生素E等，但效果有限。
外泌体是所有细胞均可分泌的一种直径在30~150 nm的细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV），由磷脂双分子层构成骨架，四分子交联蛋白和跨膜蛋白等嵌插和贯穿于双分子层，内部包含各种核酸（包括信使RNA和非编码RNA）、脂质和蛋白质等。外泌体非编码RNA不仅在疾病发生时有差异性表达，而且还可作为治疗性调控分子被递送到受体细胞并发挥生物学功能。基于以上特性，外泌体非编码RNA有望应用于DIC的早期诊治。本文对DIC目前常规的诊疗措施、外泌体非编码RNA作为DIC诊治手段的研究以及未来发展前景进行综述，以期提高心内科和肿瘤科医师对外泌体非编码RNA应用于肿瘤心脏病学领域的认识。
1 阿霉素心脏毒性的常规监测和治疗手段
1.1 阿霉素心脏毒性的监测手段
阿霉素的“脱靶效应”会引起心肌细胞损伤，导致心律失常、心肌病甚至充血性心力衰竭。阿霉素造成的心肌损伤具有剂量依赖性，化疗启动之日即心功能损伤开始之时。DIC所致的心功能损伤早期表现隐匿，可通过观察患者阿霉素化疗后出现的心脏相关症状，并结合心肌损伤标志物（如肌钙蛋白、肌酸激酶和乳酸脱氢酶）以及心力衰竭标志物（如利钠肽家族等）初步判断，但这些方法的特异性较低。
虽然心电检查能检测出抗癌治疗所致的心律失常，但美国梅奥诊所的一项研究表明，阿霉素引发的心律失常发生率较低，因此心电检查不适用于DIC的筛查。目前，指南推荐采用超声心动图进行心脏整体收缩功能的评估。然而，采用左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）检测阿霉素所致心脏损伤的敏感性不高，因为很可能在LVEF下降前患者心肌组织即发生了病理变性，如细胞水肿、心肌纤维化等。心脏磁共振可以检测出蒽环类药物导致的早期心肌纤维化，但患者体内如存在起搏器、支架或钢板等金属植入物，则可使其应用受限。此外，心脏磁共振检查价格较高，不宜作为常规筛查方式。心脏放射性核素扫描被认为是诊断DIC的“金标准”，但存在辐射暴露风险。
综上，针对DIC的早期诊断，目前临床上尚无敏感性、特异性均较高，且兼具安全性与经济性的有效手段。
1.2 阿霉素心脏毒性的治疗方法
阿霉素损伤心脏的主要机制包括三个方面：① 嵌入心肌细胞DNA双链之间的碱基，从而抑制DNA的复制和转录；② 抑制拓扑异构酶Ⅱ，使DNA去螺旋化，从而抑制DNA的复制和转录；③ 与铁离子形成复合物，促进自由基的生成，提高心肌细胞氧化应激水平，从而破坏细胞膜，导致心肌细胞损伤和死亡。
目前，对DIC有预防作用的药物右丙亚胺可通过竞争性螯合铁离子来抑制自由基的产生，从而降低心肌细胞的氧化应激水平，减轻DIC。但右丙亚胺的作用有限，且存在引发继发性肿瘤的风险。当患者出现栓塞、冠脉痉挛、心肌病、心力衰竭或心律失常等DIC相关后果时，临床医师除了停用、减少阿霉素用量和调整用药策略外，常选择β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、钙通道阻滞剂、抗凝或抗心律失常药物等对症治疗，但仍然无法从根本上解决问题。我国癌症发病率居高不下，患癌人口基数庞大，抗癌治疗引发心脏毒性的问题将愈发突出，造成很多患者陷入“得了肿瘤却死于心脏病”的困境。在此背景下，探索新型、有效的DIC治疗药物已是迫在眉睫。
2 外泌体非编码RNA在阿霉素心脏毒性诊治中的作用
外泌体中包含丰富的非编码RNA，既可以作为早期诊断DIC的标志物，也可作为递送分子用于DIC的治疗。
2.1 阿霉素心脏毒性早期诊断的标志物
微小RNA（microRNA, miRNA）是一类长度在19~23 nt的非编码RNA。转录组测序结果表明，血液中的非编码RNA在多种心血管疾病中的表达存在明显差异。非编码RNA作为诊治心血管疾病靶标的作用已经明确，并有部分已逐渐推广应用到临床。已有相关综述较为系统地总结了循环miRNA作为预测DIC标志物的研究。与游离形式的非编码RNA特性类似，外泌体非编码RNA亦具备成为DIC诊断标志物的潜力，且比前者更稳定。
BEAUMIER等对患有骨肉瘤的实验犬在排除既往心脏疾病和易患心肌病体质后给予单独的阿霉素化疗，在化疗前、中、后分别检测血浆肌钙蛋白水平、血浆EV-miRNA和进行超声心动图检查，并将上述几种心功能损伤的检测手段进行对比。结果显示，化疗后血浆EV中的miR-107、miR-146a和miR-502与化疗前比较差异有统计学意义，其中miR-502的表达明显升高，且这种变化早于现有的心肌损伤检测（包括cTnT、超声心动图等）阳性结果之前；miR-107和miR-146a表达下降，这种差异性表达与之前研究中儿童接受单独阿霉素化疗后血液中miRNA表达的变化结果一致。但是EV来源的这三种miRNA能否作为DIC的标志物，仍需更大临床样本进行验证。LI等用阿霉素处理AC16心肌细胞，发现处理后的心肌细胞外泌体中circ-SKA3表达升高，并且通过miR-1303/TLR4轴增强阿霉素诱导的心肌细胞毒性。虽然该研究只是阐明了外泌体来源环状RNA介导阿霉素损伤心肌的一种机制，但也提示了外泌体circ-SKA3可能成为DIC诊断标志物。
现阶段尚缺乏针对外泌体来源非编码RNA作为阿霉素化疗心肌损伤标志物的研究，其原因可能包括以下几方面：① 干扰因素较多，无法确定外泌体非编码RNA变化的原因。目前临床上多采用联合化疗方案，如对乳腺癌患者通常采用“阿霉素+曲妥珠单抗”的化疗策略，对小细胞肺癌患者多采用“铂类+依托泊苷”的经典化疗方案，因此，外泌体非编码RNA的变化可能是多种药物综合影响的结果；再者，肿瘤本身的变化是否会影响外泌体非编码RNA也需要纳入考虑；加之癌症患者通常合并其他慢性基础疾病，如糖尿病、心脑血管疾病等，使外泌体非编码RNA的变化原因进一步复杂化。因此，最理想的是能够找到仅采用阿霉素化疗且无合并其他基础疾病的患者，确定阿霉素化疗为唯一变量。② 化疗患者出现心脏毒性的时间不定，目前我国患者随访意识淡薄，因此很难通过随访期间的心功能相关检查发现DIC。若能通过严格纳入标准、开展长期大规模规律随访以及采用科学严谨的统计分析手段等举措排除以上干扰因素，明确与阿霉素损伤相关的外泌体非编码RNA的变化，则有望将外泌体非编码RNA用于DIC的早期诊断。
2.2 阿霉素心脏毒性的治疗
人类基因组中约98.5%的序列为非编码RNA，其本身不编码蛋白，但具有强大的基因调控功能。虽然非编码RNA已被证实在心血管系统中可发挥重要的调控作用，但由于存在胃肠道降解、靶向性不足等缺点而限制了其用于治疗。经外泌体包被的非编码RNA有望克服上述不足，发挥更好的治疗效果。
2.2.1 外泌体微小RNA治疗阿霉素心脏毒性
miRNA通过与靶向信使RNA（mRNA）进行碱基互补配对，调控转录后的基因表达。某些miRNA已被证明能调控心肌细胞增殖，外泌体及其递送的非编码RNA对心肌损伤亦显示出较强的修复能力。理论上，经外泌体递送的非编码RNA相较游离非编码RNA具有更好的稳定性和修复效果。
由于氧化应激在DIC的发展过程中居于中心地位，因此，抑制氧化应激造成的心肌细胞衰老及程序性死亡、促进心肌细胞增殖是DIC的常规治疗思路。而对具有抑制氧化应激或促进心肌细胞增殖效应的miRNA进行外泌体包被，对外泌体进行人工改造，可减少其被单核巨噬细胞系统吞噬，再经过特异性靶向心肌细胞，即可减轻DIC。
除此以外，肿瘤细胞对阿霉素耐药可造成阿霉素使用剂量的累加，由此产生的过量阿霉素对心肌细胞慢性炎症损伤的问题亦有待解决。化疗耐药的问题在乳腺癌治疗过程中尤为明显。DENG等采用阿霉素治疗小鼠乳腺癌，发现小鼠体内可在耐药慢性炎症环境中产生骨髓源性抑制细胞，该细胞分泌的外泌体miR-126可诱导肿瘤血管形成，促进乳腺癌细胞肺转移，并且正反馈地促进炎症因子和炎性细胞生成，从而形成恶性循环。因此，抑制骨髓源性抑制细胞来源的外泌体miR-126将有助于解决阿霉素耐药问题。临床上治疗三阴性乳腺癌失败的主要原因同样是化疗耐药和癌细胞转移。研究发现，人单核细胞白血病细胞（tohoku hospital pediatrics-1，THP-1）外泌体miR-770可以通过促进三阴性乳腺癌细胞凋亡，降低癌细胞对阿霉素化疗的耐药性，而阿霉素化疗敏感组织中的miR-770表达上调则提供了临床证据。研究发现，对阿霉素耐药的胃癌细胞株分泌的外泌体中富含miR-501，后者可通过丝氨酸或苏氨酸激酶Akt途径抑制胃癌细胞的凋亡，并促进癌细胞的增殖和迁移。当发生胃癌阿霉素化疗耐药时，通过抑制外泌体miR-501或许可有效抑制癌症并降低耐药性。
2.2.2 外泌体长链非编码RNA治疗阿霉素心脏毒性
长链非编码RNA （long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度>200 nt的非编码RNA，可通过内源性竞争海绵作用结合并抑制miRNA，从而间接调控靶基因的表达。越来越多的证据显示，lncRNA参与心肌细胞的衰老、增殖和修复等过程。有研究发现一种能够负性调控心肌细胞增殖和修复的lncRNA CPR，在成年小鼠中特异性敲除CPR可促进心肌细胞增殖并改善心脏功能。lncRNA还具有改善心脏重构、抑制心肌细胞自噬和细胞凋亡的作用。lncRNA在肿瘤进展调控和心肌损伤修复方面作用强大，外泌体lncRNA在治疗DIC方面的作用同样值得期待。
WANG等研究发现，对阿霉素耐药的乳腺癌细胞分泌的外泌体lncRNA H19表达明显增加，而通过抑制H19可降低癌细胞活力和诱导癌细胞凋亡，从而显著降低阿霉素抗性，这提示H19可作为减轻乳腺癌阿霉素耐药性的治疗靶点。既往研究支持间充质干细胞来源外泌体治疗DIC的作用和前景，基于此，我们团队对骨髓间充质干细胞来源外泌体进行了一系列研究，涉及其减轻阿霉素心脏毒性的机制和作为早期诊断标志物等方面，初步发现外泌体lncRNA介导铁死亡的可能信号调控通路。有报道指出，经缺氧处理之后间充质干细胞来源的外泌体lncRNA MALAT1表达明显增加，可通过竞争性结合miR-92a-3p并激活ATG4a来改善线粒体代谢，从而有效避免阿霉素引起的心肌损伤。根据当前的研究结果，采用外泌体包被lncRNA治疗DIC是一个有前景的研究方向和治疗策略，但还需要更加深入和证据确凿的应用研究成果作为支撑。
3 存在的问题与未来展望
虽然外泌体非编码RNA在DIC诊治中表现出较大潜力，但要真正应用于临床道阻且长，目前仍然存在如下问题：① 超高速离心法是分离外泌体的“金标准”，但离心过程中外泌体损失较多，而采用其他方法获取外泌体虽然能克服上述缺点，但是纯度不高；② 开展外泌体相关研究要么依赖于超高速离心设备，要么依赖于外泌体提取试剂盒，前者对实验室平台要求较高，后者经济成本较高；③ 针对外泌体的基础研究需要与临床研究相结合，理想的临床试验不仅纳入标准严格，而且由于其为前瞻性研究，因此需要多中心的研究人员多年协作参与。虽然存在种种困难，但是机遇与挑战同在。世界范围内的学者对外泌体研究仍保持饱满的热情与十足的信心，年发文量呈爆发式增长，外泌体专刊不断开设；我国国家自然科学基金等科研项目对外泌体研究的支持力度较大，研究前景一片光明。
临床上已经探索出一些可用于DIC监测的超声心动图技术，如实时三维超声心动图、心肌应变的组织多普勒成像和应变率成像。随着相关技术的发展，未来的心脏超声技术将会更早地发现心脏微小损伤，提供敏感性更高的DIC早期检测手段。同样，阐明各种化疗药物导致心脏毒性的机制，也将为寻找治疗靶点提供科学依据。无论是蛋白修饰还是外泌体，无论是影像学检查还是非编码RNA，无论是传统中药还是西药，我们都应当保持开放的心态，让各种学术观点百花齐放、百家争鸣，彼此互为补充，最终殊途同归，阐明心脏毒性具体机制，发现有效的诊治手段。相信随着我国心内科和肿瘤科专家对肿瘤心脏病学的认识不断加深，肿瘤心脏病学的多学科会诊将在我国各级医院逐步开展，符合我国国情的化疗药物引起心脏毒性的相关指南也将陆续发布，使临床实践有章可循，最终造福于患癌人群。
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