导语
今天给同学们分享一篇鉴定非肿瘤免疫浸润和铜死亡相关亚群的生信文章“Identification of immune infiltration and cuproptosis-related subgroups in Crohn’s disease”，这篇文章于2022年11月17日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。克罗恩病(CD)是一种由多种病因引起的异质性、功能失调的免疫介导的肠道慢性和复发性炎症。铜死亡是一种新发现的程序性细胞死亡形式，它似乎会促进多种疾病的发展。因此，作者研究的主要目的是检查铜死亡相关基因在CD中的作用。
1. 合并GEO数据和DEG识别
合并数据集由437个CD样本和46个对照样本组成，是通过从GEO数据集中删除批次效应获得的（图1A、B）。作者使用Limma方法共识别出5865个DEG，DEG的火山图和热图如图1C、D所示。
图1 GEO数据集组合和差异表达基因
2. DEGs的功能和通路富集分析
作者在R中进行了GO和KEGG富集通路分析。GO富集分析揭示了中性粒细胞介导的免疫的富集、免疫系统过程的负调节、中性粒细胞活化、对细菌来源分子的反应以及对脂多糖的反应。此外，作者还展示了细胞-基质连接、粘着斑、含胶原蛋白的细胞外基质、富含ficolin-1的颗粒和运输囊泡的富集。此外，在分子功能方面，还发现了生长因子结合、DNA结合转录抑制活性的富集、跨膜受体蛋白激酶活性和蛋白酪氨酸激酶活性（图2A）。根据KEGG分析，根据KEGG分析发现DEGs富集于以下项目：PI3-Akt信号通路、MAPK信号通路、趋化因子信号通路、TNF信号通路和HIF-1信号通路（图2B）。
图2 通路富集分析
3. 免疫浸润
由于作者发现免疫相关基因可能影响CD的发病机制，因此作者进行了免疫细胞浸润研究，以进一步阐明CD的免疫调节。结果显示，CD患者具有较高比例的活化CD4T细胞、活化树突细胞(DC)、CD56bright自然杀伤(NK)细胞、CD56dimNK细胞、γδT细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞(pDC)、调节性T细胞(Treg)、Th1细胞、Th17细胞和Th2细胞，同时活化B细胞和未成熟B细胞没有显示出显着差异（图3A）。23类免疫细胞之间的关联表明，大多数浸润性免疫细胞紧密相连，CD56dimNK细胞或Th17细胞除外（图3B）。不同类型的免疫细胞在CD患者中独特地浸润，这可能作为CD的可能治疗靶点。
图3 CD患者的免疫细胞浸润
4. 通过机器学习识别铜死亡基因特征
在5765个DEG和52个铜死亡相关基因相交后筛选出25个CuDEG（差异表达的铜死亡相关基因）（图4A）。CD样品和正常样品之间CuDEGs的整体表达如图4B所示。更重要的是，大多数CuDEG的表达水平较低。在获得CuDEGs后，利用LASSO回归、SVM和随机森林算法筛选潜在基因，以构建铜死亡特征（图5A-C）。最后，鉴定了一个7个基因铜死亡特征，包括BACE1、ABCB6、GLS、FDX1、MT1M、PDHA1和LIAS（图5D）。如图5E所示，除ABCB6和BACE1外，大多数铜死亡特征基因彼此高度相关（图5E）。为了预测CD，分析了七个基因特征的ROC曲线。值得注意的是，MT1TM在七个关键基因中具有最高的AUC，值为0.759。BACE1、ABCB6、GLS、FDX1、PDHA1和LIAS的其他AUC值分别为0.72、0.649、0.73、0.631、0.685和0.678（图5F）。这些结果表明所有七个基因特征都具有极好的诊断价值。
图4 CD中CuDEG的筛选
图5 机器学习
5. 铜死亡相关基因与免疫细胞及GSEA的关系
作者进行了Spearman相关分析以查看这些诊断基因是否与免疫细胞浸润有关，以便更好地了解这些关键铜死亡相关基因在免疫浸润中的功能。根据相关性分析，包括PDH1、MT1M、LIAS、GLS和FDX1在内的五个诊断基因与大多数免疫细胞的浸润表现出强烈的负相关关系（图6A-E）。而ABCB6与10种免疫细胞呈显着负相关（图6F）。有趣的是，BACE1是唯一与几乎所有免疫细胞的浸润呈显着正相关的基因（图6G）。如图7A–G所示，ABCB6、BACE1、FDX1、GLS、LIAS、MT1M和PDHA1在代谢和免疫相关通路中高度富集。
图6免疫浸润细胞与PDH1、MT1M、LIAS、GLS、FDX1、ABCB6和BACE1的相关性
图7ABCB6、BACE1、FDX1、GLS、LIAS、MT1M和PDHA1的GSEA分析
6. 聚类分析
使用“ConsensusClusterPlus”包执行共识聚类分析。7个与铜死亡相关的基因表达用于确定k=2提供了最稳定的分组（图8A）。从那时起，从GEO数据库获得的437个CD样本在一致的聚类分析中被分成两个不同的类别，即聚类A（低表达组，n=219）和聚类B（高表达组，n=218)。如PCA图所示，聚类之间的基因表达模式不同（图8B）。通过热图和箱线图可视化两种亚型中CuDEG的表达水平（图8C、D）。很可能，大多数与铜死亡相关的基因，包括GLS、FDX1、MT1M、PDHA1和LIAS，在聚类B中的表达水平高于在聚类A中的表达水平，尽管ABCB6和BACE1没有。
图8 CD中铜死亡亚型的鉴定
7. 铜死亡亚群间的GSVA
通过GSVA分析，富集了几个具有差异表达的通路，并将它们显示在热图中。与聚类B相比，聚类A中mTORC1信号、死亡、干扰素-干扰素-α、TNF-α信号、IL2-STAT5信号和IL6-JAK-STAT3信号的Hallmark活性更高，而胆汁酸代谢、脂肪生成和脂肪酸代谢较低（图9A）。在聚类A中，与丙酮酸和丁酸代谢相关的KEGG通路的表达显着降低，而NOD样受体信号、细胞因子受体相互作用、趋化因子和白细胞跨内皮迁移相关通路的表达显着升高（图9B）。基于Reatcome通路，GSVA的结果显示A聚类中干扰素信号通路、白细胞介素6信号通路、白细胞介素12信号通路和抗原处理交叉呈递相关通路显着富集。相比之下，响应元离子FOXO介导的氧化应激代谢和神经元基因和细胞内受体的SUMO化在聚类B中得到丰富（图9C）。
图9 GSVA分析
8. 两个铜死亡亚群之间的功能区别
为了更多地了解两个亚群之间的功能差异，进行了差异表达分析。共获得440个DEG，包括205个上调和235个下调的DEG。它们之间的DEG分布显示在火山图上（图10A）。然后对440个DEG进行GO和KEGG富集分析，以进一步了解可能的分子过程和功能。GO分析(BP)表明，基因在细胞趋化性、白细胞趋化性、髓系白细胞迁移、粒细胞迁移和中性粒细胞迁移方面富集；顶端质膜、质膜分泌颗粒膜、细胞投射膜和刷状缘膜（CC）的外侧；信号受体激活剂活性、细胞因子活性、趋化因子活性和氧化还原酶活性，作用于配对供体，并掺入或减少分子氧(MF)（图10B）。此外，KEGG富集分析发现，这些基因主要富集在细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、蛋白质消化吸收、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用、维生素消化吸收等免疫系统相关通路（图10C、D）。有趣的是，与GSVA分析的结果一致，表明A组的整体免疫浸润更大，发现A组患者在ssGSEA中具有相当高水平的所有23种免疫细胞（图10E）。
图10 铜死亡亚型之间的功能富集分析和免疫细胞浸润
总结
通过一系列生信分析，作者揭示了铜死亡相关基因与浸润免疫细胞之间的关联，以及具有不同铜死亡亚群的CD患者免疫反应的巨大异质性。选择基于七基因的铜死亡特征作为最佳机器学习模型，可以准确评估CD亚型和CD患者的诊断。作者的研究结果首次揭示了铜死亡参与CD的进展，并为潜在的致病过程和潜在的CD治疗策略提供了新的见解。
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