导语
今天给同学们分享一篇内质网应激+WGCNA+分型+分子对接的生信文章“Comprehensive analysis of endoplasmic reticulum stress-associated genes signature of ulcerative colitis”，这篇文章于2023年5月23日发表在Front Immunol期刊上，影响因子为8.786。
内质网应激（ERS）是溃疡性结肠炎（UC）发展的关键因素，然而其潜在的分子机制仍不清楚。本研究旨在确定与UC发病相关的内质网应激的关键分子机制，并为UC提供新的治疗靶点。
1. DEGs的鉴定和功能注释以及DEGs的通路富集
作者使用“limma”软件包分析了UC患者和健康对照组结肠粘膜中的差异表达基因（DEGs），并使用p值<0.01和|log 2 FC|>1作为阈值，鉴定出了915个DEGs，其中593个上调，322个下调（图1A）。热图展示了DEGs的表达模式以及组内的相对一致性（图1B）。
图1 UC相关的DEGs的鉴定
此外，作者对这915个差异表达基因进行了通路富集分析，以更好地了解溃疡性结肠炎中的潜在机制和功能。GO富集分析结果表明这些基因在信号通路中的显著参与，如白细胞迁移、白细胞趋化和中性粒细胞迁移（图1C）。KEGG富集分析结果显示多个与炎症反应相关的通路被激活，包括IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、B细胞受体信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路（图1D）。
2. ERSRGs的识别
使用WGCNA进行模块分类，作者确定了六个模块（图2A，B）。根据模块与UC之间的相关系数，作者选择了与UC具有最高相关性的蓝色模块（r=0.66，p=6e−15）作为关键模块（图2C）。作者从蓝色模块中筛选出了680个中心基因，用于后续分析，筛选标准为GS >0.25和MM >0.7（图2D）。
图2 UC相关模块的识别
通过使用Venn图鉴定ERGs、DEGs和中心基因的共同基因，作者得到了28个ERSRGs（图3A）。为了确定它们之间的相互作用，作者使用STRING数据库构建了一个PPI网络，并使用cytoHubba-MCC插件鉴定出了11个度数大于10的基因（图3B）。随后，作者使用MCODE插件鉴定出了两个聚类模块，其中聚类模块1的得分较高（得分为10.6000，11个节点和53条边），与cytoHubba-MCC分析的结果一致（图3C）。作者使用iRegulon插件测试了这11个基因的转录因子（TF）结合模式，结果显示所有基因都受NFAT5调控（图3D）。
图3 ERSRGs的鉴定
图3E显示了UC组和健康对照组之间的11个ERSRGs的表达模式。作者还分析了ERSRGs之间的相关性，并发现了显著的协同效应（图3F）。随后，作者进行了ROC分析，以验证ERSRGs的诊断意义（图3G）。所有基因的曲线下面积（AUC）值均大于0.75，其中VCAM1的AUC值最大（AUC为0.986），而IL-6的最小（AUC为0.888）。
3. 针对UC患者的潜在治疗药物预测
作者将11个ERSRG提交到CMap数据库，以筛选出可用于UC管理的有前景的小分子化合物。通过这种方法，作者确定了五种潜在的小分子药物，它们具有抑制微管的效果：阿苯达唑、氟苯达唑、氟苯达唑、格氏菌素和诺斯卡平（图4A）。这些化合物的结构从PubChem数据库中获取，并显示在图4B-F中。根据药物和基因之间的相关性分数，作者选择了诺斯卡平进行后续分析。
图4
4. UC药物在对抗ERS方面的分子对接景观
分子对接是一种重要的基于结构的药物设计和筛选方法，通过寻找小分子化合物和靶分子之间的最佳构象来进行相互作用。在本研究中，作者从RCSB蛋白质数据银行下载了五个具有高分辨率（小于3 Å）的分子靶点的晶体结构，即CCL4（PDB ID：3TN2）、IL1B（PDB ID：5R8Q）、MMP9（PDB ID：6ESM）、SELP（PDB ID：1G1Q）和PTGS2（PDB ID：5F19）。作者使用AutoDock Tools1.57软件对诺斯卡平和具有最大折叠差异的五个分子靶点进行对接。对接得分小于-6 kcal/mol，表明诺斯卡平与靶点之间具有很高的结合亲和力。结合位姿和位点如图5所示，红色表示化合物，黄色虚线表示氢键相互作用。
图5 分子对接模式
5. ERSRGs的验证
为了验证11个ERSRGs的表达水平，作者使用了一个外部数据集（GSE206285）。与健康对照组相比，UC患者结肠组织中ERSRGs的表达水平显著升高（图6A）。ROC分析显示，除了PTPRC外，所有ERSRGs的AUC值均大于0.750（图6B）。根据ROC分析结果，作者进一步分析了10个ERSRGs（不包括PTPRC）。在GSE179128数据集中，这些基因的水平在活动性UC患者中较非活动性UC患者更高，除了IL-6（图6C）。作者还分析了GSE107499数据集，该数据集包含活动性UC患者的炎症性和非炎症性结肠组织。在该数据集中未检测到CCL4，因此作者验证了其他九个ERSRGs的表达，发现它们在活动性UC患者的病变结肠组织中上调（图6D）。
图6 ERSRGs（A，B）的外部验证
6. 活动性溃疡性结肠炎的免疫浸润景观
CIBERSORT算法被用来描述两组结肠组织中22种免疫细胞浸润的丰度。图7A显示了两组样本中免疫细胞类型的分布，而图7B则展示了两组之间浸润免疫细胞丰度的差异。与健康对照组相比，发现UC患者结肠粘膜中浸润的活化树突状细胞、M0和M1巨噬细胞、活化肥大细胞、中性粒细胞、活化CD4+记忆T细胞、滤泡辅助T细胞和γ&δ T细胞水平较高。图7C描述了22种免疫细胞类型之间的相关性，其中Tregs和单核细胞显示出最高的相关性（r = 0.7）。
图7 GSE206285数据集中UC组和健康对照组之间的免疫特征
接下来，作者研究了10个ERSRGs与免疫细胞之间的相关性（图7D）。结果显示，天然B细胞、CD4记忆激活T细胞、滤泡辅助T细胞、M0和M1巨噬细胞、活化树突状细胞、γ&δ T细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞与这10个ERSRGs呈正相关，其中中性粒细胞与之相关性最强。
7. 活动性溃疡性结肠炎的结肠黏膜侵袭与ERS相关
生物制剂，如TNF-α抑制剂英夫利昔单抗（IFX）、戈利木单抗（GLM）和IL-12/IL-23抑制剂乌斯替金单抗（Ust），已获批用于治疗UC，并被提议作为中度至重度UC的一线治疗。使用GSE73661、GSE92415和GSE206285数据集探索了生物制剂对ERS的影响。结果表明，在IFX治疗之前，UC患者的ERSRGs与健康对照组相比显著升高，除了IL-6和CCL4。在临床反应组中，PTGS2、ICAM1和SELP的表达水平与非反应组相比显著降低（图8A）。在IFX临床反应组中，除了IL-6和CCL4之外，ERSRGs的表达在IFX治疗后显著降低（图8B）。重要的是，在临床反应组中，VCAM1、TLR2和MMP9的表达水平在IFX治疗后恢复到健康对照组的水平（图8C）。
图8 IFX和GLM的应答者通过调节ERSRGs改善UC患者的受损结肠粘膜
GSE92415 包含了接受 GLM 治疗的 UC 患者活检样本的表达谱。在 GLM 治疗之前，活动性 UC 患者的所有 10 个 ERSRGs 的表达水平与健康对照组相比较高，临床反应组中 IL1RN、ICAM1、CCL4、TLR2、SELP 和 IL1B 的表达水平明显低于非反应组（图 8D）。GLM 治疗后，临床反应组中 IL-6、ICAM1、CCL4、VCAM1、TLR2、SELP 和 MMP9 的表达水平降低（p<0.05）（图 8E）。然而，只有 TLR2 的表达水平恢复到健康对照组的水平（图 8F）。
最后，GSE206285包含了中度至重度溃疡性结肠炎患者基线活检样本的表达谱。在使用乌斯替治疗之前，临床反应组的ERSRGs明显减少，与非反应组相比，除了VCAM1（图9A）。此外，该数据集评估了接受乌斯替治疗的溃疡性结肠炎患者的黏膜愈合情况。作者发现，黏膜愈合患者的基线ERSRGs表达模式与临床反应者相似（图9B）。
图9 Ust通过调节ERSRGs（A，B）减少UC患者的受损结肠粘膜
8. 鉴定与溃疡性结肠炎相关的ERS亚型
为了说明UC的ERS相关模式，作者对GSE206285数据集中的550个UC样本进行了无监督聚类分析，使用了基于10个ERSRGs表达模式的“ConsensusClusterPlus” R软件包。当k=2时，作者观察到稳定的异构体数量（图10A、B），并且在k=2到k=6的CDF曲线下面积的相对变化中存在显著差异（图10C）。当k=2时，亚型的一致性得分最高（全部超过0.8）（图10D）。因此，根据PCA分析观察到的显著差异，作者将550个UC样本分为两个亚型，即亚型1（n = 491）和亚型2（n = 59）（图10E、F）。
图10 ERS相关亚型的鉴定和丰富分析
为了更好地了解亚型之间的分子特征，作者评估了10个ERSRGs的表达差异。结果显示，所有10个ERSRGs在亚型2中显著升高（图11A、B）。进一步分析揭示了两个亚型之间基因表达模式的显著差异（图11C、D）。
图11 ERS相关亚型特征基因的鉴定
为了评估Ust治疗对UC患者的两个不同亚型（亚型1和亚型2）的影响差异，作者进行了比较分析。结果显示，在接受8周Ust治疗后，亚型1组UC患者的黏膜愈合率和临床反应率明显较高（图11E，F）。
作者进行了GSVA分析，以评估与ERS相关亚型中富集的功能和通路的差异。分析结果显示，包括IL1β产生、IL1产生、IL1受体结合、对IL-6的反应、IL-1介导的信号通路、Toll样受体结合和生长因子受体结合等多种通路在亚型2中上调（图12A）。此外，亚型2中还上调了FCγR介导的吞噬作用、凋亡和细胞因子相关通路（图12B）。此外，B细胞受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒作用、JAK/STAT信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、NOD样受体信号通路和VEGF信号通路也在亚型2中富集。
图12 不同ERS相关亚型的免疫特征
作者还观察到亚型1和亚型2之间免疫细胞浸润的丰度差异（图12C-E）。亚型1显示出更多的静止树突状细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、静止肥大细胞、浆细胞、CD8 T细胞、γ&δ T细胞和调节性T细胞。亚型2显示出更多的活化树突状细胞、活化肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞、活化NK细胞和幼稚CD4 T细胞。
总结
作者在UC中确定并验证了10个ERSRGs。探索了现有UC治疗对ERSRGs表达的影响。此外，还确定了针对UC治疗中ERS的小分子新靶点。结果表明，ERS在UC发病机制中起着重要作用，并且诺斯卡平可能是一种通过影响ERS来治疗UC的有希望的治疗药物。
联系客服
