在缺乏 NEMO 的情况下，激活典型 NF-kB 通路会导致肝细胞死亡，原因是抗凋亡基因表达丧失8 。.因此，作者研究了肝脏炎症如何影响这些小鼠的细胞死亡和代偿性增殖。虽然肿瘤组织中促炎性细胞因子 Tnfa、Il6、Il1β 以及炎性体成分 Caspase-1 和 Nlrp3 的 mRNA 表达量保持不变，但肿瘤组织中的骨髓浸润却增加了。髓系 CD11b + 的浸润与无大肿瘤的全肝组织中较高的促炎基因 Tnfa、Tlr4、Il1β、Nlrp3 和 Ccl5 的基因表达水平有关。以前的报道表明，NLRP6的缺失会导致NLRP3 27 的过度激活。.虽然 Nlrp3 的表达在 mRNA 水平上有所增加，但作者无法在蛋白质水平上证实这一点。此外，Nlrp3 基因表达在 13 周早期没有变化，这表明在 NLRP6 缺失的情况下，NLRP3 炎性体的过度表达并不能介导观察到的表型。52周龄小鼠的炎症表型与NEMO ∆hepa /Nlrp6 ∆hepa 的pJNK明显活化有关。/Nlrp6 −/− 小鼠的 pJNK 激活有关，这与 Caspase3 裂解染色显示的肝细胞凋亡增加以及 KI67 染色显示的代偿性增殖有关。这些数据共同表明，NLRP6 的缺失协调了肿瘤微环境中的炎症反应，并推动了 NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠肝脏疾病向纤维化和癌症发展。/Nlrp6 −/− 小鼠。
通过对肠道不同部位的紧密连接（TJ）蛋白Zonula occludens1（ZO-1）进行免疫荧光染色，对肠道屏障功能进行了更详细的研究。与 WT 小鼠相比，52 周大的 NEMO∆hepa 小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠中 ZO-1 的表达量减少。然而，NEMO ∆hepa 但是，NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠的 ZO-1 进一步减少，这在回肠和结肠中最为明显。同样，在 52 周大的 NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠的回肠和结肠组织裂解液中，也发现闭锁素蛋白表达减少。/Nlrp6 −/− 小鼠的回肠和结肠组织裂解物中的闭塞素蛋白表达量比 NEMO ∆hepa 小鼠低。有趣的是，TJ屏障的破坏与炎症基因（如Il1β、Il18、Mcp1和Ccl5）mRNA表达的增加以及回肠组织中CD11b + 细胞浸润的增加有关。总之，缺乏 NLRP6 表达导致的肠道菌群失调会破坏肠道 TJ 屏障，增加炎症基因的表达。
接下来，作者研究了 NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠肠道菌群失调和肠屏障受损的功能影响。/Nlrp6 −/−小鼠肠道菌群失调和肠屏障受损的功能影响。在这里，作者对一组 52 周大的 NEMO ∆hepa 和 NEMO ∆hepa 小鼠的体内肠屏障功能进行了评估。/Nlrp6 −/− 小鼠和各自的对照组。用 4000 kDa FITC-葡聚糖测量肠屏障的通透性，NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠的通透性显著增加。/Nlrp6 −/− 与 NEMO {{7} 对照组相比，肠屏障的通透性明显增加。令人震惊的是，ALT水平和肿瘤数量与肠道通透性密切相关，表明肠道屏障受损会加剧NEMO ∆hepa 小鼠的肝病。
mMDSCs除了具备PRRs，可在暴露于MAMPs {{0}时触发炎症反应外，还具有在癌症发展过程中抑制T细胞的能力。｝mMDSCs还具有在癌症发展过程中抑制T细胞的能力。有趣的是，NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠的细胞毒性CD8 + 显著减少。T 细胞（定义为 CD45 + CD3 + CD8 + ）和 CD4 + T 细胞（定义为 CD45 + CD3 + CD4 + ）。与抑制 T 细胞一致，mMDSC 丰度与细胞毒性 T 细胞成反比（**p = 0.0040，r = -0.5767）。其他免疫髓系和淋巴免疫细胞亚群，包括 Kupffer 细胞、NK/NKT 细胞和 B 细胞保持不变。作者观察到，NEMO ∆hepa /Nlrp6 ∆hepa 中常见的 M2 标记 Arg1 表达增加，而 M1 标记 Nos2 表达减少。/Nlrp6 −/− 小鼠中，M1标记物Nos2的表达增加了，这表明这些小鼠体内存在有利于肿瘤生成的微环境。
不能根据细胞表面标记物的表达来充分定义 MDSCs 30 。.因此，作者进行了额外的染色和功能测试，以进一步研究这些细胞的表型。CD11b + mMDSCs和CD8 {{2}T 细胞显示出密切的接近性，这在 NEMO ∆hepa /Nlrp6 ∆hepa 的肝脏中最为明显。/Nlrp6 −/− 小鼠的肝脏中最为明显。接下来，作者分离并进一步鉴定了这些细胞，并通过体外实验探索了它们对 T 细胞的抑制能力。从 WT 和 Nlrp6 − /− 脾脏中分离出 T 细胞。/−脾脏中分离出T细胞，用CFSE标记，用CD3/CD28刺激，并与从NEMO ∆hepa 或NEMO ∆hepa 分离出的粒细胞MDSC（定义为CD45 + Ly6G + Gr1 hi ）或mMDSCs（定义为CD45 + Ly6G − Gr1 hi ）共培养。/通过磁激活细胞分拣（MACS）从NEMO ∆hepa 或NEMO ∆hepa −/− 肝脏中分离出CD45 {{10} Ly6G {{11} Gr1 hi 。作者没有观察到 WT 和 Nlrp6 −/− 小鼠之间 T 细胞增殖的基线差异。此外，T 细胞增殖在与两种基因型的肝脏 gMDSCs 共同培养时也不受影响。然而，mMDSCs 强烈抑制了 CD8 + T 细胞的增殖。T 细胞的增殖，这在与从 NEMO ∆hepa /Nlrp6 ∆hepa 分离出来的 mMDSCs 共同培养时最为明显。/Nlrp6 −/− 肝脏中分离出来的mMDSCs共同培养时，抑制CD8+T细胞增殖的作用最为明显。
为了检验微生物群是否会影响 NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 肝脏的肝脏炎症反应，作者对 8 周大的小鼠进行了治疗，直到第 13 周。/Nlrp6−/−肝脏中的微生物群是否会影响肝脏炎症反应，作者使用一种已确定的非吸收性广谱抗生素（ABx）组合治疗8周大的小鼠至第13周。正如之前所描述的 31 ，这种治疗方法几乎完全治愈了小鼠的肝脏。 31 ，这种治疗导致了几乎完全的微生物群耗竭，表现为盲肠增大，与无菌小鼠相似，而且粪便样本中的细菌DNA总含量也显著降低，这一点可以通过使用所有细菌的引物进行qPCR检测来证明。令人震惊的是，ABx 治疗后，肝脏中 NEMO ∆hepa /Nlrp6 {∆hepa 的转氨酶水平降低了。/Nlrp6 −/− 小鼠的肝脏转氨酶水平与 NEMO ∆hepa 小鼠相似，与未接受治疗的小鼠相比显著降低。
使用 ABx 清除微生物群可改善 NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠的肝损伤、抑制 mMDSC 的浸润并恢复细胞毒性 T 细胞的丰度。/Nlrp6−/−小鼠的肝损伤。为了进一步检验Nlrp6 −/− 微生物群的致病相关性，作者对NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/−小鼠进行了粪便微生物群转移（FMT）。/Nlrp6 −/− 小鼠转入NEMO ∆hepa 小鼠。根据成功的 FMT，NEMO ∆hepa 接受 NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 微生物群形成了一个独特的集群，该集群靠近NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 微生物群在基于 Bray-Curtis 差异性的 NMDS 排序分析中，FMT-捐赠者形成了一个独特的聚类。微生物群转移导致 NEMO ∆hepa 微生物群沿 NMDS 轴 1 转移。DESeq2 和 LEfSe 分析比较了有无 FMT 的 NEMO ∆hepa 小鼠，发现这种转移主要是由 A. muciniphila 的丰度差异驱动的。令人震惊的是，所有接受 FMT 的 NEMO ∆hepa 小鼠都缺乏粘液噬菌体，而且在 LEfSe 分析中，比较 NEMO ∆hepa 和 NEMO ∆hepa 小鼠只观察到一个不同的 OTU（OTU23_ambiguous_taxa）。FMT 受体与 NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 。FMT-受体，进一步证明了微生物群转移的成功。
NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠的肠道微生物群在 13 周和 52 周后与 NEMO ∆hepa 小鼠有显著差异。13 周和 52 周后，NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 与 NEMO ∆hepa 小鼠的肠道微生物群明显不同。有趣的是，微生物群调节立即重塑了肝脏炎症微环境。因此，在最后一项实验中，作者旨在探索微生物群的哪些具体变化可能会调节 NEMO ∆hepa 小鼠的肝病活动。LEFSe分析表明，13周龄和52周龄的NEMO ∆hepa /Nlrp6 ∆hepa 小鼠体内的粘液噬菌体相对减少。/Nlrp6 −/− 与 NEMO ∆hepa 小鼠相比。13周龄和52周龄的NEMO ∆hepa /Nlrp6 −/− 小鼠体内的粘液噬菌体明显减少。/Nlrp6 −/− 和 NEMO ∆hepa 小鼠接受 FMT 治疗后，粘液噬菌体明显减少。此外，在 NEMO ∆hepa 微生物群中，A. muciniphila 的相对丰度与肝脏 mMDSC 的丰度成反比（Spearman-r = 0.8508，p = 0.0005），与血清 ALT 和 GLDH 水平也成反比，凸显了这些细菌在介导观察到的表型方面的相关性。
转录组学数据的 PCA 显示肝硬化患者和对照组有明显的聚类。使用 PROGENy 34,35 工具进行的通路分析发现，与对照组相比，肝硬化患者的纤维炎症通路 TGFβ、NFκB、TNFα 和缺氧，以及与肝损伤修复、再生和恶性转化相关的通路，如表皮生长因子受体、MAPK、P53、PI3K 和 WNT，均显著上调。MAPK （r = 0.366，p = 0.0464）和 TGFβ（r = 0.383，p = 0.0367）信号通路的激活与肝脏中 16S rDNA 的丰度相关。此外，梭状芽孢杆菌的丰度与 MAPK、表皮生长因子受体、TNFa 和 NFκB 通路的激活相关。在肝硬化患者中，通过DoRothEA 35 推断出的一些致癌转录因子（TFs），包括FOS、ETS2、RELB、SOX10、ERG、WT1和JUND，以及支持干性的TFs，如PBPJ和ARID3A，都出现了上调，并与细菌易位相关。此外，癌症相关基因与16 S rRNA基因丰度相关。
10.细菌转运塑造肝硬化患者的炎症微环境并促进 T 细胞衰竭标志物的表达
根据鼠类数据，作者接下来专门研究了细菌转运对人类肝硬化肝脏炎症环境的影响。为此，作者使用 xCell 36 根据基因表达谱对肝细胞景观进行了计算剖析。.肝硬化肝脏的微环境、基质和免疫 xcell 分数反映了整体免疫细胞和基质细胞的富集，而肝细胞分数则相对降低。有趣的是，较高的 16S rRNA 基因丰度与 CD8 + T 细胞、NKT 细胞、肝细胞和肝癌细胞的增加有关。T细胞、NKT细胞、中心记忆CD4 + 和调节性T细胞，后者与肿瘤免疫抑制有关。这些数据共同表明，肝硬化患者的细菌转运与纤维炎症途径以及与免疫抑制和 T 细胞衰竭相关的 TF 激活密切相关。
至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下。作者首先深入地探讨了固有免疫和适应性免疫中ILCs和ILTCs的特性；第二部分阐述了它们在癌症免疫监视中的核心角色；第三部分揭示了连接适应性免疫与固有免疫的关键桥梁；第四部分描述了基于ILC和ILTC的免疫治疗策略及其未来的治疗展望。文章知识丰富，提供了许多作者进行生信分析深入研究的起点，做免疫研究的小伙伴们千万不要错过哦！
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