24+单细胞+空间转录组，杀伤力拉满的发文思路！

导语

结果：

CRC中的单细胞转录组景观

作者对7名患有远处转移的CRC患者的29个样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），其中包括8个原发性CRC、5个oCRC、2个lCRC、7个相邻正常组织和7个外周血单个核细胞（PBMC）样本。作者还下载了公开可用的24名患者的41个样本的scRNA-seq数据，其中包括29个CRC和12个相邻正常组织样本，以增加统计学能力。在这24名患者中，有3名患者有远处转移，但详细的转移信息不可得知。因此，最终分析中，作者有31名患有CRC的患者，其中包括10个远处转移。所有的CRC都被诊断为微卫星稳定（MSS）CRC。工作流程和患者及组织样本的详细信息如图1A和在线补充表1和2所示。

经过质量控制和批次校正，作者分析了230,818个细胞的scRNA-seq数据，其中167,205个（72.44%）来自作者自己的样本（在线补充图1A）。使用不同细胞群集的经典标记物，作者鉴定出10种细胞类型，包括4种非免疫细胞类型，如上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和胶质细胞，以及6种免疫细胞类型，如B细胞、T细胞、髓系细胞、肥大细胞、巨核细胞和浆细胞B细胞（图1B-C和在线补充图1B-D）。然后，作者计算了这10种细胞类型在不同组织类型中的比例，如图1D-E和在线补充表3所示。

干细胞是结直肠癌转移的起源

作者对表达EPCAM和KRT18的上皮细胞进行了细分（在线补充图2A），发现在所有患者中存在14个细胞亚型（图2A和在线补充图2B）。这14个细胞亚型的标记基因显示在图2B中。在这14个细胞亚型中，作者确定了5个恶性细胞亚型，包括高表达ASCL2和PTPRO的干细胞样细胞，表达DNAJB1和RND3的DNAJB1恶性细胞，表达FDPS和SCD的FDPS恶性细胞，表达GPRC5A和SLC2A1的GPRC5A恶性细胞，以及表达IL32和S100A11的IL32恶性细胞（图2B和在线补充图2C-E）。作者发现，肠上皮细胞富集于正常结肠组织中，胆管上皮细胞富集于结直肠癌组织中，而干细胞样恶性细胞和其他恶性细胞亚型则富集于原发性和转移性结直肠癌样本中（图2C）。原发性结直肠癌和转移性结直肠癌中的干细胞样恶性细胞亚型的DNA拷贝数变异显著高于邻近正常组织中的上皮细胞（图2D-E和在线补充图2F）。然后，作者应用CytoTRACE 14 来预测五种恶性细胞亚型的分化状态，结果显示干细胞样细胞在结直肠癌（lCRC）或直肠癌（oCRC）中具有明显更高的分化潜力（在线补充图2G）。基于分区的图形抽象分析显示，干细胞样细胞与恶性细胞亚型之间的进化关系更为密切，而与其他上皮细胞亚型之间的关系较远（图2F）。RNA速度分析表明，流向是从干细胞样细胞到其他恶性细胞亚型（图2F）。此外，干细胞样细胞在所有上皮细胞亚型中具有最高的干细胞特征得分（图2G）。这些结果表明，干细胞样细胞可能是结直肠癌转移的起源。

作者应用轨迹推断算法来预测原发肿瘤和转移性肿瘤中恶性细胞亚型的流动方向。结果显示，在原发和转移性结直肠癌中，其他恶性细胞似乎来自干细胞样细胞（在线补充图2H）。作者进一步进行了差异表达基因分析，发现与其他细胞亚型相比，干细胞样细胞的PTPRO和一些干细胞相关标记物（包括ASCL2、LGR5、AXIN2、EPHB2、SOX9、PROM1、CD44和ALCAM）显著上调（图2H）。作者还发现干细胞样细胞中MYC靶基因V1和WNT/β-连环蛋白信号通路的基因表达显著上调（图2I）。然而，恶性细胞亚型之间的表达程序是异质的；例如，一些脂肪酸代谢、糖酵解和糖异生通路中的基因在FDPS恶性细胞中高度表达，而趋化因子信号通路和白细胞经内皮迁移通路中的一些基因在GPRC5A恶性细胞中高度表达。IL32 + 恶性细胞过度表达核糖体基因（在线补充图2I）。作者通过使用基因表达数据库（GEO）和癌症基因组图谱（TCGA）-结肠腺癌（COAD）RNA-seq数据集获得了类似的结果，显示具有远处转移的原发性CRC或转移性CRC中的干细胞样基因特征显著增高（在线补充图3A、B）。作者分析了TCGA-COAD RNA-seq数据集，并根据干细胞样特征评分确定了三种CRC亚型。干细胞样特征评分较高的患者存活时间显著较短（在线补充图3C-F）。此外，作者发现ASCL2和PTPRO的表达水平在具有高干细胞样特征评分的乙状结肠癌中高于具有低干细胞样特征评分的乙状结肠癌（在线补充图3G-I）。

ASCL2和PTPRO的过度表达赋予结直肠癌干细胞转移特性

ASCL2，一种基本螺旋-环结构转录因子（TF），是肠道干细胞的关键调节因子，参与了CRC的增殖和运动 15 16 ，由于作者的CRC样本中类似干细胞具有较高的PTPRO RNA水平（图3A），因此作者分析了ASCL2和PTPRO表达水平之间的关系，并发现存在显著且正相关（在线补充图4A）。这个结果鼓励作者对原发性CRC样本进行空间转录组和免疫荧光分析。结果显示，一种上皮细胞亚型高度表达ASCL2和PTPRO（图3B-C），表明ASCL2可能是PTPRO的转录因子。然后，作者在两种CRC细胞系中进行了基因操作实验来验证这一观点，结果显示，在ASCL2耗竭的细胞中，PTPRO的mRNA和蛋白水平显著降低；但在PTPRO耗竭的细胞中，ASCL2的表达水平没有显著变化（图3D和在线补充图4B、C）。这些结果进一步表明ASCL2是调控PTPRO表达的转录因子。作者还在GSE75117数据集中研究了PTPRO RNA在原发性CRC肿瘤中心、浸润前沿和腹膜转移中的水平，并发现转移灶中的水平显著高于原发性肿瘤中心或浸润前沿（图3E）。基于PTPRO RNA水平的Kaplan-Meier估计和多变量分析显示，PTPRO水平高的MSS CRC患者的生存时间显著短于PTPRO水平低的患者（图3F和在线补充图4D）。最后，作者研究了PTPRO表达变化对CRC细胞表型的影响，发现PTPRO沉默显著降低了CRC细胞的迁移、侵袭能力（图3G和在线补充图4E），以及球体传播能力（在线补充图4F）。综上所述，这些结果表明原发性CRC包含一种具有ASCL2和PTPRO高表达特征的干细胞亚型，这赋予了CRC转移表型。

CRC干细胞在器官特异性CRC转移中的异质性

接下来，作者希望探索干细胞样细胞亚型是否存在异质性，可能与器官特异性转移有关。根据转录组学特征，作者将干细胞样细胞分为八个不同的亚群（P1至P8），如图4A所示。所有这些细胞都表现出干细胞特性，其中一个亚群显示出较高的增殖能力（在线补充图5A）。作者发现，在八个亚群中，P1和P2在原发结直肠癌（oCRC）中富集，而P3和P4在转移性结直肠癌（lCRC）中富集。在原发结直肠癌和oCRC中，P1细胞的百分比分别为48.57%和45.85%，而在原发结直肠癌和lCRC中，P3细胞的百分比分别为65.35%和24.64%（图4B-C，在线补充图5B、C和表4）。oCRC和lCRC中P1和P3细胞的高比例表明，这些干细胞样细胞分别是结直肠癌转移到这两个器官的起源。作者分析了来自五名患者的每个原发结直肠癌（oCRC）中细胞亚群的定位，结果支持了从P1到P2的进化趋势；同样，来自两名患者的每个转移性结直肠癌（lCRC）的结果也显示了从P3到P4的潜在进化趋势（在线补充图5D、E）。空间转录组分析显示了与这些结果一致的P1和P3细胞的空间分布模式（图4D）。基因表达分析显示，P1和P2细胞具有MAFA和DLL4的独特高表达，而P3和P4细胞具有TOMM6、CXCL14、ATP6V0C、PSMA6、CALML4、DBNDD2、RNASE4和DEFB1的高表达（图4E）。胆管细胞的表达模式也类似于P3和P4细胞（在线补充图5F）。P6细胞与转移无关，但表达了一组基因，包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、VEGFA、ASPSCR1和IGF2（图4E）。P1和P3细胞之间基因表达特征的差异在原发性结直肠癌中得到验证（图4F），并且在oCRC或lCRC中保持了不同的表达模式（图4G和在线补充图5G）。临床组织样本的免疫组化染色显示，与转移到肝脏的原发性结直肠癌相比，转移到卵巢的原发性结直肠癌DLL4表达水平较高（图4H和在线补充图6A）。根据受试者工作特征曲线下面积的计算结果，DLL4表达水平能够预测卵巢转移的能力（图4I）。作者还通过尾静脉将ASCL2、PTPRO或DLL4沉默的结直肠癌细胞移植到小鼠体内，结果显示与对照组细胞移植相比，卵巢转移率显著降低（图5A-C）。由于转录因子通过调节特定基因的表达在维持细胞表型和命运中起关键作用，因此作者探索了是否存在决定干细胞样细胞转移潜能的转录因子。主要转录因子分析表明，在P1细胞中，ELF3是卵巢癌恶性表型的主要转录因子 17 ，而ETV4是与肝癌发展相关的主要转录因子在P3细胞中 18 （在线补充图6B）。临床组织样本的免疫组化染色显示，转移至卵巢的原发性结直肠癌（CRC）具有比转移至肝脏的CRC更高的ELF3水平，而转移至肝脏的原发性CRC具有比转移至卵巢的CRC更高的ETV4水平（在线补充图6C）。这些结果表明，由不同主要转录因子引起的干细胞样细胞的异质性可能决定了原发性CRC的器官特异性转移。

CRC转移中干细胞与CAF和分化的内皮细胞的相互作用

众所周知，癌症转移既取决于癌细胞本身，也取决于肿瘤微环境中的其他细胞类型，包括CAF和内皮细胞。根据特定标记物，作者在所有样本中鉴定出13种成纤维细胞亚型，包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、外周细胞和平滑肌细胞（图6A和在线补充图7A‒C），在这些亚型中，有9种在原发性结直肠癌样本中富集（在线补充图7D‒E）。然后，作者计算了配体-受体对的吸引力强度，以寻找可能介导CAF与类干细胞相互作用并促进结直肠癌转移的分子。作者发现，在类干细胞与CAF之间的配体-受体对中，PDGFA-PDGFRA、DLL4-NOTCH2和DLL4-NOTCH3对在P1细胞中显著富集，尽管许多其他配体-受体对出现在与转移无关的P6细胞中（图6B）。使用另一种工具iTALK进行的分析得出了类似的结果，显示P1细胞通过DLL4-NOTCH2、DLL4-NOTCH3和PDGFA-PDGFRA的配体-受体相互作用与CAFs之间的串扰更强，相比之下，P6细胞的串扰较弱（在线补充图7F）。然后，作者计算了DLL4-NOTCH2、DLL4-NOTCH3和PDGFA-PDGFRA配对的相互作用得分，这些得分经过了相应细胞分数的校正，并分析了它们与TCGA-COAD队列中患者生存时间的相关性。结果显示，高得分的MSS CRC患者的生存时间明显短于低得分患者（图6C和在线补充图7G）。

作者还对内皮细胞进行了亚分类，并确定了10个亚群（图6D-E，在线补充图8A、B）。其中，Art_NOTCH4（DLL4的另一个受体）、Tip_COL4A1、Veins_ACKR1和Veins_SERPINE1亚型在原发性结直肠癌中富集（图6F）。对TCGA-COAD数据集中这四个细胞亚型的基因特征进行富集分析发现，转移患者的Art_NOTCH4和Tip_COL4A1得分显著高于无转移患者。相反，无转移患者的Veins_ACKR1和Veins_SERPINE1得分高于有转移患者（图6G）。对癌细胞系百科全书（CCLE）数据库进行分析得到类似结果，显示Art_NOTCH4和Tip_COL4A1的特征得分与结直肠癌细胞系的转移潜力呈正相关，而Veins_ACKR1和Veins_SERPINE1的特征得分与转移潜力呈负相关（在线补充图8C）。差异表达分析显示，Art_NOTCH4和Tip_COL4A1细胞在一些信号通路的激活上有相似之处，例如NOTCH信号通路；然而，Veins_ACKR1和Veins_SERPINE1细胞在NOTCH信号通路的基因表达水平下降（图6H）。单样本基因集富集分析表明，与两种静脉内皮细胞类型相比，Art_NOTCH4和Tip_COL4A1细胞的NOTCH信号通路得分显著较高（在线补充图8D）。作者检查了TCGA-COAD数据集，结果也显示，具有转移的MSS CRC患者的NOTCH信号通路的特征得分显著较高，而没有转移的患者得分较低，并且高得分与较差的生存相关（在线补充图8E）。此外，Art_NOTCH4和Tip_COL4A1细胞在NOTCH信号通路的关键成分，即NOTCH1、NOTCH4、HEY1、JAG2和RBPJ的表达水平显著较高，与两种静脉内皮细胞类型相比（图6I）。作者发现P1细胞通过DLL4和JAG1与NOTCH1和NOTCH4的配体-受体相互作用与内皮细胞之间存在强烈的串扰，并且在TCGA-COAD队列中，P1细胞和内皮细胞相互作用的高分数与显著较短的生存时间相关（在线补充图8F）。由于肿瘤组织中的动脉和静脉毛细血管是由源自内血管前体（EVP）和过渡扩增细胞的分化（D）内皮细胞形成的，因此作者在两个批量RNA-seq数据集中确定了EVP和D内皮细胞之间的差异表达基因，并检查了这些基因在四个内皮细胞亚型中的表达模式。结果显示，34个基因在EVP中上调，而65个基因在D中上调（在线补充图8G-I）。作者发现，由这65个上调基因组成的特征分数在Art_NOTCH4和Tip_COL4A1细胞中显著高于veins_ACKR1和veins_SERPINE1细胞（图6J），这表明Tip_COL4A1和Art_NOTCH4细胞很可能是D内皮细胞。在体外的经内皮细胞迁移分析中发现，与对照细胞相比，ASCL2、PTPRO或DLL4敲除的CRC细胞的穿越内皮细胞的能力显著降低（在线补充图9A‒C）。综上所述，这些结果表明，P1细胞可以通过其过表达的配体DLL4与CAFs和D内皮细胞在原发性CRC微环境中相互作用，与CAFs和D内皮细胞上的NOTCH受体结合，可能促使它们转移到卵巢（图6K）。

卵巢癌转移中代谢特征的表征

作者发现在oCRC微环境中富集了一些独特的细胞亚型，包括P1和P2细胞以及RBP1肌成纤维细胞（MyoFib_RBP1）。MyoFib_RBP1细胞仅在oCRC中存在（图7A和在线补充图7D）。作者使用Monocle2研究了三种肌成纤维细胞亚型之间的谱系关系，结果显示发育路线始于MyoFib_COL10A1并最终结束于MyoFib_RBP1（图7B）。然后，作者应用MEBOCOST来研究肌成纤维细胞与恶性细胞之间的代谢物-传感器通信，并发现MyoFib_RBP1细胞在所有肌成纤维细胞中作为发送者与FDPS恶性细胞之间的通信最多（152个事件），而FDPS恶性细胞在所有恶性上皮细胞中作为接收者的通信最多（259个事件）（图7C）。作者还发现，在MyoFib_RBP1细胞与FDPS恶性细胞之间的所有代谢物-传感器伴侣中，L-谷氨酰胺及其转运体的通信得分明显高于其他代谢物（图7D）。根据这一点，与MyoFib_COL10A1细胞相比，MyoFib_RBP1细胞的GLUL基因表达显著增加，该基因编码将谷氨酸转化为谷氨酰胺的酶。FDPS恶性细胞中GLUL RNA水平低于MyoFib_RBP1细胞，表明FDPS恶性细胞产生谷氨酰胺的能力较低，需要外部补给（图7E）。TCGA-COAD数据集的分析还显示GLUL RNA水平与FDPS恶性特征评分之间存在显著的负相关关系（在线补充图10A）。此外，在oCRC中，FDPS恶性细胞显示异常活化的氧化磷酸化、糖酵解、D-谷氨酰胺/D-谷氨酸代谢和TCA循环（图7F），这表明某些基因的表达水平及其催化代谢物的增加（图7G-H和在线补充图10B-D）。作者发现人类CRC细胞中的GLUL mRNA水平和培养基中的谷氨酰胺含量低于人类卵巢成纤维细胞（在线补充图10E-F）。然后，作者用无谷氨酰胺培养的人类卵巢成纤维细胞培养基培养CRC细胞。对培养的CRC细胞进行细胞内谷氨酰胺分析显示，与对照培养基培养的CRC细胞相比，谷氨酰胺水平显著升高。此外，卵巢成纤维细胞的培养基与对照培养基相比，显著促进了CRC细胞的增殖。然而，使用谷氨酰胺转运蛋白ASCT2（SLC1A5）抑制剂V-9302处理CRC细胞，显著消除了卵巢成纤维细胞培养基的促增殖作用以及CRC细胞内谷氨酰胺（在线补充图10G-H）。对五种恶性细胞亚型的基因调控网络分析表明，HOXA13仅在占领卵巢的FDPS恶性细胞中高度表达（在线补充图10I，J）。这些结果表明，oCRC中的FDPS恶性细胞代谢活跃，肌成纤维细胞可以为这些癌细胞提供谷氨酰胺进行谷氨酰胺代谢。

TIGIT是oCRC免疫治疗的潜在靶点

作者对CD4细胞进行了无监督聚类，并鉴定出了9个亚型，这些亚型表达CD4但不表达CD8A，这些细胞表达高水平的CD40LG或FOXP3（在线补充图11A、B）。作者还对CD8细胞进行了聚类，并鉴定出了12个亚型，这些亚型表达高水平的CD8A，但不表达CD4、CD40LG或FOXP3（在线补充图11C-D）。作者根据标记基因的表达将CD4细胞分为九个亚型，即类似幼稚细胞（SELL、TCF7、LEF1）、记忆细胞（FOS、JUN、IL7R、CXCR4）、效应细胞（GZMA、GZMB、IFNG、NKG7）、耗竭细胞（PDCD1、CXCL13、CTLA4）和调控细胞（FOXP3、IL2RA、IKZF2）。作者发现，在原发性结直肠癌和转移性结直肠癌中主要存在高水平表达GZMA、GZMB、IFNG、PDCD1和CXCL13的CD4_ALOX5AP亚型，而FOXP3调节性T细胞主要存在于原发性结直肠癌和非左结直肠癌，而不是左结直肠癌（在线补充图11E）。作者鉴定了12个CD8细胞亚型，包括类似幼稚细胞（SELL，TCF7，LEF1），中央记忆细胞（FOS，JUN，IL7R，CXCR4），效应记忆细胞（GZMK，EOMES），应激反应细胞（HSPA1A，HSPA1B），效应细胞（GZMA，GZMB，IFNG，NKG7），耗竭细胞（PDCD1，CXCL13，CTLA4），MAIT细胞（SLC4A10和ZBTB16），dg T细胞（TRGC2，TRDC）和增殖细胞（MKI67，STMN1）。具有高表达热休克蛋白的CD8细胞在oCRC中特别丰富（在线补充图11F）。先前的研究表明，这种CD8细胞亚型与免疫检查点抑制剂治疗的预后不良有关。23 然后，作者计算了配体-受体对的吸引力强度，以寻找可能介导与卵巢转移相关的CAF和oCRC中富集的T细胞之间相互作用的分子，并发现THBS1-CD47，NECTIN2-TIGIT，MDK-NCL，LAMA4-CD44和CXCL12-CXCR4对显著富集（在线补充图11G，H）。作者还发现，T细胞中的TIGIT表达水平显著高于PDCD1（程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）），相应的免疫检查点配体CD274（程序性死亡配体1（PD-L1））在肿瘤微环境中的癌细胞或成纤维细胞中几乎不表达，而TIGIT免疫检查点配体NECTIN2在癌细胞和成纤维细胞中高度表达（在线补充图11I）。这些结果表明，PD-1/PD-L1配对可能不是oCRC中主要的免疫检查点信号分子。相反，TIGIT-NECTIN2配对可能是重要的免疫检查点分子。

总结

作者揭示了器官特异性结直肠癌转移的机制。

微信号：ShengxinSCI