在过去的20年里,Illumina引领了新一代测序(NGS)技术的变革,使探索基因组、转录组和表观基因组变得更简单,也更经济。Illumina推出的最新平台NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统,提供了突破性的系统设计、创新的化学测序技术、可兼顾多种文库制备方法的高兼容性,以及机载集成式生信分析软件。
NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统均采用Illumina边合成边测序(SBS)化学技术,该技术支持包括NextSeq 550系统在内的所有Illumina平台。Illumina SBS化学技术生成了全球90%以上的测序数据1,该技术可大大减少错误read2,实现了全基因组范围内的可靠碱基检出3。
NextSeq 1000和NextSeq 2000系统经过优化后增强了簇亮度,减少了通道串扰,并提高了信噪比。NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统结合了光学和仪器设计领域的最新技术,提高了数据输出量,降低了每次运行的成本,同时生成用户所期待的,与NextSeq 550系统一样的高质量数据。
本应用说明表明NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统在关键应用(包括外显子组、群体细胞和单细胞RNA基因表达)中可呈现出与NextSeq 550系统相当的数据质量。
外显子组测序
使用Nextera™ DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents Kit(Illumina,货号 20025524)从NA12878基因组 DNA(gDNA)(Coriell医学研究所)样本中制备外显子组文库,再由Illumina Exome Panel(Illumina,货号 20020183)捕获其中的目标基因组区域。
使 用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit(200 个 循 环 )(Illumina 货号 20040557)在 NextSeq 2000*系统上测序,运行配置为 2×100 bp。为了进行比较,使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5(300 个循环)(货号 20024908)在NextSeq 550系统上对相同文库进行测序,运行配置为 2×100bp。每台仪器在单次运行中可对 8 个样本进行多重测序。
*尽管 NextSeq 2000系统的通量高于 NextSeq 1000系统,但两者的性能和数据质量不相上下。因此,本应用说明中仅选用NextSeq 2000系统进行数据比较研究。
使用DRAGEN™ Enrichment Pipeline v3.4进行二级数据分析,它可在NextSeq 2000系统上运行或通过BaseSpace™ Sequence Hub运行。根据 Platinum Genomes 2016 v1.0数据集评估变异检出的准确性4。
群体细胞mRNA测序
使用TruSeq™ Stranded mRNA Library Prep Kit(Illumina,货号20020594)从通用人类参比 RNA(Coriell 医学研究所)样本中制备信使RNA(mRNA)文库。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit(200 个循环)在NextSeq 2000系统上对其测序,运行配置为 2×76bp。为了进行比较,使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5(300 个循环)在 NextSeq 550系统上对相同文库进行测序,运行配置为 2×76 bp。每台仪器在单次运行中可对24个样本进行多重测序。
使用DRAGEN RNA Pipeline v3.5.112进行二级数据分析,它可在NextSeq 2000系统或BaseSpace Sequence Hub上运行。数据与基因组参照序列联盟的人类标准基因GRCh38(组装 h38)进行比对。
单细胞RNA测序
单细胞RNA测序(scRNA-Seq)的样本是用4重外周血单核细胞(PBMC)制备的,后者从单个供体的全血中分离而来。使用Chromium Single Cell Gene Expression v3 Solution(10x Genomics,货号1000092)在Chromium Controller(10x Genomics,货号 120223)上从约1000个PBMC中制备文库。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit(200 个循环)在NextSeq2000系统上对其测序。为了进行比较,使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5(150 个循环)(Illumina,货号20024907)在NextSeq 550系统上对相同文库进行测序。根据10x Genomics提供的参数设置运行配置:read 1 28个循环,index read 8个循环,read 2 91个循环。
使用Cell Ranger scRNA-Seq分析流程(10x Genomics公司)进行数据分析,以比对read、成簇和分析基因表达。
外显子组测序
评估包括单核苷酸位点变异(SNV)和插入 / 缺失(indel)的查准率和查全率、运行输出数据量(产量)、错误率、匹配read百分比、平均靶点覆盖深度和覆盖度均一性在内的初级和二级分析指标。NextSeq 550和NextSeq 2000系统在测序数据输出量和数据质量方面都超过了公布的技术规范,两个测序平台都保有出色的测序性能(表1)。这些数据表明,NextSeq 2000系统和 NextSeq 550系统的外显子组测序结果不相上下,两个平台都能提供高质量的数据和高度准确的变异检出。
表1:外显子组测序性能相当
群体细胞mRNA测序
NextSeq 550和NextSeq 2000系统在测序数据输出量和数据质量方面都超过了公布的技术规范(表2)。通过群体细胞mRNA-Seq对特定RNA靶点进行定量,结果表明在四次重复实验中两个平台之间具有良好的一致性(R2>0.99)(图1)。这些数据证实了在定量 mRNA 表达水平时,NextSeq 2000系统生成的数据质量与NextSeq 550系统相当。
表2:群体细胞mRNA-Seq性能相当
图1:高度一致的mRNA-Seq结果——使用NextSeq 550系统通过细胞群mRNA-Seq 对特定 RNA 靶点进行定量,并绘制在 y 轴上。NextSeq 2000 系统的结果绘制在 x 轴上。沿着 y = x 趋势线观察数据的一致性(四次重复试验的R2>0.99)。
单细胞全转录组测序
NextSeq 550和 NextSeq 2000系统在测序数据输出量和数据质量方面都超过了公布的技术规范(表3)。在 scRNA-Seq 中使用独特分子标签(UMI)对单个细胞进行定量,结果表明在四次重复实验中两个平台之间具有良好的一致性(R2>0.99)(图2)。这些数据进一步证明在开展 scRNA-Seq 研究时,NextSeq 2000系统生成的数据质量与NextSeq 550 系统相当。
表3:scRNA-Seq性能相当
图2:scRNA-Seq结果高度一致——使用 NextSeq 550 系统通过 scRNA-Seq 对单个细胞(UMI)进行定量,并绘制在 y 轴上。NextSeq 2000 系统的结果绘制在 x 轴上。沿着 y = x 趋势线观察数据的一致性(四次重复试验的 R2>0.99)。
NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统具有突破性的系统设计、创新的化学测序技术并且机载生信分析软件,彻底改变了台式测序系统的性能。这些平台降低了测序成本并提高了运行能力,同时保持了用户对Illumina期望的高质量数据。将常在NextSeq 550 系统上运行的关键应用数据,包括外显子组、群体细胞mRNA和单细胞 RNA 测序,直接与NextSeq 2000系统生成的数据进行比较。结果显示,NextSeq 550和NextSeq 2000系统的性能高度一致,反映了 Illumina对始终提供一致、高质量的测序性能的承诺。
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