越来越多的科研学者使用二代测序(Next-Generation Sequencing)进行自己课题研究,很多科研人员选择将样本直接寄送到二代测序科服公司进行实验。很多人可能并不了解文库构建的完整流程,今天小编就给大家介绍几种常见文库构建的流程。
一. DNA建库流程:
DNA建库的完整流程:
基因组DNA片段化:由于目前测序仪读长有限,如双端各测150bp或75bp等,可采用酶打断和超声打断两种方式,酶打断操作更方便,更节省时间,但目前酶打断还有一定的偏好性,超声打断还是主流打断方式;
末端修复:打断后的DNA末端会有粘性末端,需要进一步补平成平末端;
加A:与接头T互补配对,增加接头连接效率;
加接头:接头是一段固定序列,能够与芯片配对发生成簇反应,可分为长接头(index在接头上,index区分不同文库样本),短接头(index通过PCR引入);
磁珠纯化:一般此步骤采取两步磁珠纯化,根据磁珠优先吸附大片段原理,通过使用不同体积磁珠,第一步磁珠纯化去除大片段,第二步磁珠纯化去除小片段,从而得到合适片段长度文库;
PCR扩增:通过接头引物扩增富集文库;
磁珠纯化:纯化文库;
文库质检:一般先用Qubit进行文库定量,然后使用2100仪器进行文库片段分析,通过qPCR进行绝对定量,混样上机。
二、 mRNA建库流程:
mRNA分离:mRNA的3’端有Poly A结构,利用Oligo dT磁珠将mRNA从总RNA中拉出来。mRNA建库对RNA质量要求较高,一般要求RIN值大于7,RNA发生降解会引起只能捕获到mRNA 3’端信息,5’端信息会发生丢失;
mRNA片段化:一般使用Mg离子及高温打断,片段化长度与打断时间相关;
一链二链合成:将mRNA先反转录成cDNA,再进行二链合成;
DNA建库:后续步骤和DNA建库步骤相同,只是不要打断步骤。
三、LncRNA建库流程
LncRNA建库流程与mRNA建库整体流程类似,只是第一步mRNA纯化改为rRNA去除,目前市面rRNA去除主要有四种方法:
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