本文由廖维瑶编译，董小橙、江舜尧编辑。
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母亲肥胖与后代肥胖和非酒精性脂肪肝(NAFLD)发病风险增加有关，但这种关联的原因尚不清楚。婴儿早期肠道微生物定植对于免疫和代谢功能的建立起着至关重要的作用。在这里，我们用肥胖(Inf-ObMB)或正常体重(Inf-NWMB)母亲的生育2周大的婴儿的粪便微生物(MB)移植到无菌小鼠体内，再比较两种菌群来源不同的小鼠。(inf-obmb）移植小鼠显示内质网应激和先天免疫相关的肝基因表达增加，同时伴有门静脉周围炎症的组织学现象，而这种组织学现象在儿科NAFLD病例中更为常见。Inf- ObMB小鼠肠道通透性增加，巨噬细胞吞噬减少，细胞因子的产生受到抑制，提示巨噬细胞功能受损。此外，Inf-ObMB小鼠进行西式饮食会促进体重增加并加速NAFLD。总的来说，这些结果为支持母亲肥胖相关的婴儿微生态失衡在儿童肥胖和NAFLD中的致因作用提供了功能性证据。
论文ID
原名：The gut microbiota in infants of obese mothers increases inflammation and susceptibility to NAFLD
译名：肥胖母亲生育的婴儿的肠道微生物群增加了炎症和NAFLD的易感性
期刊：Nature Communication
IF：12.353
发表时间：2018年
通信作者：Taylor K. Soderborg
通信作者单位：科罗拉多大学安舒茨医学院儿科
实验设计
图1 实验设计的示意图
实验内容
1 Inf-ObMB增加盲肠短链脂肪酸浓度和肠道通透性
我们从每组的2 - 3个婴儿中收集粪便样本，在GF小鼠中进行定殖，并进行了多轮实验，如图1所示。在门水平,Inf-ObMB定殖小鼠与Inf-NWMB定殖小鼠相比，厚壁菌门丰度较高和拟杆菌门丰度较低(图2),这一结果也与样本量更大的人群婴儿队列研究相似。Inf- nwmb定殖小鼠中拟杆菌门与厚壁菌门的比例为34.2，而Inf- obmb组为5.64 (P = 0.005)。拟杆菌门与厚壁菌门的比例下降与大多数动物模型的肥胖发生是一致的，但并不是所有的人类研究都证实了两者的关联。在纲水平上，Inf-ObMB小鼠的Gammaproteobacteria显著减少(P = 0.01;图2b)，与之前发表的研究中的婴儿粪便肠道菌群分析结果一致。此外，Inf-ObMB小鼠Clostridia增多(P = 0.00001;图2b)，这是一种厚壁菌纲，以前被认为与青少年肥胖和纳什病有关。Inf-ObMB小鼠与Inf-NWMB小鼠相比，其盲肠短链脂肪酸(SCFA)乙酸、丙酸和丁酸浓度显著增加(1.6-、1.8-、5.7倍);P = 0.0005, P = 0.03, P = 0.002;图2c)，这一倍数与之前的两项研究-研究儿童肥胖和成人NAFLD，结果相似。
婴儿肠道微生物群在肠道屏障的建立和保护其通透性方面起着关键作用。为了确定Inf-ObMB小鼠是否改变了肠道屏障基因的表达，我们检测了编码肠紧密连接蛋白，zo-1和occludin的基因的表达。与Inf-NWMB小鼠相比，Inf-ObMB小鼠的zo-1表达显著降低(P = 0.02)(图2d)，Ocln略微降低(P = 0.1)。为了进一步研究肠道通透性是否随紧密连接蛋白编码基因的表达的变化而增加，我们采用荧光素异硫氰酸酯(FITC)-右旋糖酐灌胃并测量荧光在血浆中的转移，测量Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠的肠道通透性。我们发现Inf-ObMB小鼠肠道通透性显著升高(P = 0.017;图2 e)。接下来，我们检查了肠道通透性升高是否与细菌向肠道外转移有关。因为16S仅存在于细菌DNA中，我们测定小鼠肝脏中总16S DNA，对Inf-NWMB和Inf-ObMB的总细菌进行了定量。Inf-ObMB肝脏中16S DNA的含量明显高于Inf-NWMB (P < 0.0001;图2 f)。此外，我们还在体外测量了小鼠肝脏的细菌生长。与Inf-NWMB小鼠相比，Inf-ObMB小鼠的肝脏有更多的细菌生长的(P = 0.17,图S1A);根据菌落颜色、大小和形态的差异,表明Inf-ObMB肝脏中四种细菌的变异比Inf-NWMB肝脏中四种细菌的变异更大(图S1B)。
图2 Inf-ObMB改变肠道菌群，增加肠道通透性。
图S1Inf-ObMB小鼠肝脏中细菌的增长。
2 Inf-ObMB改变胆汁酸的组成和代谢
考虑到肠道菌群在胆汁酸代谢(BA)中的重要作用，我们检测了肠道菌群移植小鼠肝脏和粪便中的BA含量。Inf-ObMB与Inf-NWMB老鼠的肝脏BA含量没有显著差异(图S2 A,B;图3 a)。与Inf-NWMB小鼠相比，Inf-ObMB小鼠的粪便中初级(P = 0.03)、次级(P = 0.03)、共轭次级(P = 0.006)和总(P = 0.08) BAs减少(图S2 C,D;图3 b)。在Inf-ObMB小鼠中，BA合成限速酶Cyp8b1和Cyp7a1 mRNA在肝中的表达增加(P = 0.01；P = 0.07)(图3 c)。此外，肝脏BA胆盐输出泵(Abcb11)表达降低(P = 0.02)，肝脏BA钠离子牛磺胆酸共转运多肽(Slc10a1)表达升高(P = 0.05)(图3c)。粪便中BAs的减少，肝BA合成上调和BA转入/转出基因的表达改变，这些改变与一项成人NAFLD的报道一致。Inf-ObMB小鼠肝脏BA受体FXR (Nr1h4)基因表达显著升高(P=0.03)。然而，两组之间的下游靶点Shp (Nr0b2)和Hnf4a均无差异(图3c)，与之前一项NAFLD和NASH中报道的FXR-SHP信号轴改变一致。
图3 Inf-ObMB粪便BA流失增加，改变肝脏BA稳态基因的表达
图S2 在Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠肝脏(A, B)和粪便(C, D)中分别进行BA测量
3 Inf-ObMB引起炎症并损害巨噬细胞功能
生命早期的微生物在体重增加和建立适当的免疫功能方面起着关键作用。我们发现，在不改变总体体重(图4a)或肝甘油三酯(图4b)的情况下，与Inf-NWMB小鼠相比，Inf-ObMB小鼠的脂肪组织蓄积显著增加(P=0.0004)。虽然肝脏甘油三酯没有升高,Inf-ObMB小鼠肝脏中肝脏脂质-氧化基因Cpt1a显著升高(P = 0.02)，主要脂质代谢调节剂Ppara (P = 0.08)和脂质储存基因Pparg2 (P = 0.08)的mRNA表达呈上升趋势(图4c)。炎症方面，我们发现，与Inf-NWMB小鼠相比，Inf-ObMB小鼠Xbp1s-一种内质网应激的标记物-表达增加(P = 0.01)，Tnf细胞因子表达增加(P = 0.02)(图4c)。此外，在Inf- ObMB小鼠肝脏中，促炎性细胞因子Ifnb1和IL-6 mRNA的表达增加了25%，但未达到显著水平(图4c)。Inf-ObMB小鼠的肠道通透性增加和肝脏促炎状态促使我们进一步研究巨噬细胞表型和功能。采用流式细胞仪检测Inf-ObMB定殖对肝巨噬细胞的影响。采用流式细胞仪检测Inf-ObMB定殖对肝巨噬细胞含量的影响。我们以F4/80 + hi/CD11blo来识别固有巨噬细胞(Kupffer细胞)，在Inf-ObMB小鼠中Kupffer细胞从44%升高到68%(P=0.06)，而募集巨噬细胞(F4/80 + lo/CD11bhi)从<1%上升到5.2% (P = 0.2)。总的来说，这导致Inf-ObMB小鼠巨噬细胞总量显著增加(P = 0.01;图4 d)。与Inf-NWMB相比，我们发现Inf-ObMB小鼠炎症细胞因子mRNA增加，固有巨噬细胞数量增加，肝门静脉周围白细胞浸润程度更大(图4e)。Inf-ObMB小鼠的肝脏改良的小儿NAFLD组织学评分(PNHS)显著高于Inf-NWMB小鼠(P = 0.017);图4f)，这主要由Inf-ObMB肝脏门静脉炎症增加所致(Mann Whitney U-test；P=0.017);图S3a)。两组均未出现微观或宏观的脂肪变性，这与预期的结果一致。骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)可以洞察分化为单核细胞，最终成为募集巨噬细胞之前被编码的变化。因此，我们检测了Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠的BMDMs基因表达。基线时，各组间IL-1b、IL-6、Tnf、IL-10表达无差异。为了测试BMDMs对脂多糖(LPS)-一种典型的来自肠道微生物群的促炎的刺激-的响应性，我们将BMDMs暴露在低剂量LPS（10ng/毫升,20 h)。与Inf-NWMB小鼠相比，Inf-ObMB老鼠IL-1b、IL-6、Tnf、IL-10的mRNA表达明显下降或有下滑趋势(P = 0.009,P = 0.08,P = 0.005,P = 0.02)(图5a)。细胞吞噬作用是巨噬细胞解决病原体炎症反应的关键步骤。为了研究Inf-ObMB改变巨噬细胞吞噬作用的能力，用表达gfp的李斯特菌孵育BMDMs。与Inf-NWMB小鼠相比，Inf-ObMB小鼠BMDMs吞噬李斯特菌的效率明显降低(P = 0.02;图5b, c)，与其细菌清除减少和体内炎症反应相一致。
图4 Inf-ObMB增加皮下脂肪和促进肝脏炎症
图S3 Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠（A,B）和Inf-NWMB WSD和Inf-ObMB WSD小鼠（C,D）改良儿科NAFLD组织学评分(PNHS)的个体得分。
图5 Inf-ObMB小鼠的BMDMs功能受损
4 西方膳食加剧了Inf-ObMB小鼠的炎症和肥胖
为了评估来自Inf-ObMB的细菌是否会加速肥胖和NAFLD的发生，我们观察了短期西餐(WSD)暴露于Inf-NWMB或Inf-ObMB的小鼠中的影响。WSD干预仅仅6周后，相较于Inf-NWMB老鼠，Inf-ObMB老鼠体重增加(P=0.06)，脂肪量(P = 0.03)和肝脏甘油三酯(P = 0.03)也明显增加(图6 c)。小鼠肝脏巨噬细胞总数在Inf-NWMB和Inf-ObMB之间相似(图6 d)。然而，在Inf-ObMB小鼠肝脏募集巨噬细胞中，促炎细胞因子IL-1b和tnf的基因表达显著升高(均P =0.02)，重要的是，抗炎IL-10的mRNA表达显著降低(P=0.02)(图6e)。经过6周的短期西餐干预，从组织学上看，Inf-ObMB小鼠的肝脏提示门静脉周和小叶炎症浸润和脂肪变性(图6f)，与Inf-NWMB-WSD小鼠相比，改良PNHS评分几乎增加了一倍(Mann Whitney U-test,P=0.09);图6 g;图S3 B)，与肝细胞因子表达结果(图6e)和甘油三酯水平(图6c)一致。重要的是，经过6周的WSD，Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠的肠道微生物组成不再不同。在门水平，Inf- NWMB小鼠的盲肠拟杆菌门与厚壁菌门的比值为7.71,而Inf-ObMB小鼠为3.15(图7a)。在纲水平上，Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠的Gammaproteobacteria和Clostridia的相对丰度不再存在差异(图7b)。此外，盲肠SCFA代谢产物醋酸酯、丙酸酯和丁酸酯在Inf-NWMB和Inf-ObMB两组之间不再存在差异(图7c)。
图6 西方膳食加重了Inf-ObMB表型
图S3 Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠（A,B）和Inf-NWMB WSD和Inf-ObMB WSD小鼠（C,D）改良儿科NAFLD组织学评分(PNHS)的个体得分。
图7 西方膳食干预6周后，Inf-NWMB和Inf-ObMB肠道菌群后无明显差异
结 论
总体而言，这些结果表明，肥胖母亲所生育的婴儿早期肠道微生物组成的变化会导致肠道通透性增加，巨噬细胞吞噬活性降低，细菌肝转移导致肝脏炎症反应增加，触发NAFLD和导致无菌小鼠体重增加。我们的研究设计为选择一组婴儿的粪便作为一轮定殖治疗的接种菌。虽然这可能限制了个体婴儿在这一发育阶段的可变性，但Inf-NWMB和Inf-ObMB小鼠在灌胃21天后的微生物群组成存在显著差异，与之前报道的NW和Ob婴儿粪便的主要组成差异一致。这一点，再加上我们在每一轮使用独特的粪便进行三轮定殖实验，加强了我们的研究结果与人类婴儿群体相关的可能性。我们认识到用拟人化的无菌小鼠推断早期巨噬细胞编码和肝脏发育的困难性。然而，我们的研究结果表明，肥胖妈妈的婴儿体内的细菌变化与肥胖症的易感性和NAFLD加速发病风险的病理变化有关。对微生态失调、肝和骨骨髓来源巨噬细胞、SCFAs、BAs和NAFLD之间的关系的进一步研究，很可能会揭示早期微生物组有助于降低代谢疾病的风险的复杂机制。到目前为止，有限的证据表明，母亲的饮食可以通过改变后代的肠道微生物学来影响婴儿早期肥胖和后天性免疫。该模型可用于研究识别婴儿的重要生物标志物-产生潜在的促进疾病或保护疾病的NAFLD表现型。未来的研究需要利用益生菌/益生元，以及了解它们的生物活性代谢物，这些代谢物可能阻止代谢紊乱，从而减缓肥胖母亲所生婴儿发生儿童肥胖症和NAFLD的风险。
（1）科研 | Nature子刊：影响婴儿微生物群落结构和功能的成熟的原因
（2）科研 | 母体幽门螺杆菌暴露，会减少后代过敏性呼吸道炎症
（3）Nature子刊：婴儿饮食和孕妇妊娠期体重增加可预测肠道微生物组的早期代谢成熟
（4）科研 | 婴儿肠道微生物组与认知发展相关（第四期文献包投票选出的文章）
（5）科研 |孕期还在胡吃海喝？小心你与宝宝的微生物组“造反”（赵方庆教授团队作品）
（6）综述 | 婴儿肠道微生物群的发育及其对健康的影响（IF：11.02）
（8）综述 | Cell 子刊：肠道菌群调节色氨酸代谢影响健康和疾病的机制研究
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