1 苏打湖的地球化学和群落组成
卡里布高原包含数百个大小，碱度和盐度不同的湖泊。在这里，研究者重点研究了四个碱化苏打湖（图1），它们具有钙化微生物垫，与古代叠层石或血栓石相似。2014年至2017年，在pH 10.1–10.7时，这些湖的总碱度在0.20–0.65 mol/L之间。四年的扩增子测序数据（16S和18S rRNA）显示，微生物垫至少包含1662个细菌和587个真核物种级操作分类单位（OTU，聚类为97％相似性）。随着时间的推移，完全不同的湖泊生物垫群落变得相似，并且保持相对稳定（图1）。Probe，Deer和Goodenough Lake的垫层主要是蓝细菌垫层，而盐水含量更高的Last Chance Lake的垫层则主要含有光养型真核生物。在四个湖泊中均发现了与340个特定的OTUs相关的细菌物种，这些物种占该地区物种丰富度的20.5％，占测序总数的84％，这表明卡里布高原的湖碱性湖中共有一个共同而丰富的核心微生物组。尽管真核生物量和光养菌的比例很高，但原核微生物组仍然存在核心碱性湖泊Last Chance Lake（尽管相对丰度较低）中。图1 卡里布高原苏打湖的图像和生物学描述。Google卫星图像，包括(a）Deer Lake, （b）Goodenough Lakes, Last Chance Lakes, and（c）Probe Lake。黑色星号表示大概的采样位置。d气泡图显示了蓝细菌和真核生物对湖泊宏蛋白质组的相对贡献。e、f基于Bray-Curtis距离的16S和18S差异性的非度量多维尺度（NMDS）图形状表示抽样年份：圆圈：2014；正方形：2015；菱形：2016；三角形：2017。g来自Goodenough Lake的微生物垫的图像，以及h Last Chance Lake沿岸的微生物垫的图像。
2 宏基因组揭示了远处湖泊之间的相似性
在扩增子测序概述了卡里布苏打湖微生物垫的核心微生物组之后，使用宏基因组测序，组装来获得关键微生物群的宏基因组组装基因组（MAGs）。研究者选择了91个具代表性的，重复复制的MAGs进行进一步分析。这些MAGs中的大多数接近完成（对于85个MAGs，> 90％），并且包含相对较少的重复保守单拷贝基因（<5％，对于83 MAGs）。对于56个MAGs，我们独立组装并binned 2–5个几乎相同（平均核苷酸同一性> 95％）的版本，这表明存在多个密切相关的菌株。扩增子测序已经表明存在超过2000种不同的细菌和真核OTUs。从宏基因组读取中重建了全长16S rRNA基因序列。基于分类学分类分析表明，其中的57个可能与一个MAG有关。全长16S rDNA基因序列与一致性OTU扩增子序列的完美比对表明，几乎所有这些MAGs都是核心卡里布微生物的成员，并且存在于每个湖泊中。图2中显示了与MAG相关的细菌的分类学分类和平均相对丰度。对于分类，研究者使用了最近建立的GTDB分类。研究者还使用GTDB工具包研究了卡里布生物垫的基因组与最近从库伦达草原中亚苏打湖沉积物中获得的800多个MAGs的相似性。这两个碱性湖泊系统之间的距离约为8000 km。然而，56个卡里布的MAGs与库伦达的MAGs聚在一起。地理上相距遥远的湖泊系统之间的相似度令人惊讶，特别是因为DNA是从库伦达沉积物而不是从其生物垫中获得的。这表明，这里为卡里布生物垫定义的核心微生物组也适用于至少一个其他描述良好的苏打湖系统。有趣的是，来自两个区域的最相似MAGs之间的遗传距离随着卡里布生物垫中丰度的增加而减小，但与库伦达沉积物的丰度无关。例如，最丰富的卡里布cyanobacterium（C1，与Nodosilinea亲缘，相对丰度> 7％）在库伦达MAG GCA_003550805的85％的基因组中显示99％的平均核苷酸同一性。后者在库伦达沉积物中的相对丰度小于0.1％。将库伦达测序直接映射到卡里布基因组没有提供任何证据表明库伦达沉积物中存在以前未检测到的细菌/MAGs，这些细菌/MAGs与卡里布细菌/MAGs更相似相比Vavourakis等人提出的水平高。这些结果表明，当卡里布湖泊在上一个冰河时代之后（约10,000年前）形成时，它们的微生物群是由一个更古老的全球嗜碱生物多样性库储集的。卡里布丰度与库伦达-卡里布相关性之间的惊人关系可能是由于更丰富的群落分散/定居的比率提高了。传播媒介的识别仍在等待未来的研究，但是鸟类的迁移是一个明显的候选者。例如，穗䳭通过北亚在加拿大北部和非洲之间迁移，这可能将世界上许多已知的苏打湖联系起来。位于mats下面的沉积物的丰度可能无法很好地解释分散性，因为与mats相比，沉积物受到分散媒介的影响较少。在任何情况下，分离相关细菌的遗传距离通常都很大，这表明在不同湖泊系统的细菌通过入侵来成功定殖是非常罕见的。自上次冰河时期以来，可能只有一种细菌（MAG C1）在其他湖泊系统之间移动并成功定殖。在其他生态岛（如温泉）上也观察到了高度隔离，因此，在远处的湖泊系统之间观察到的微生物群落相似性表明，在两个远处的苏打湖环境中，微生物垫微生物群落的群落组装具有共同的结果。未来的研究将阐述库伦达和卡里布苏打湖的核心微生物群是否也已在其他苏打湖中聚集。卡里布苏打湖之间的距离最远为40公里。对于56个含2-5个几乎相同的MAG变体（平均核苷酸同一性> 95％）中，研究者也检测到所有变体共现现象。这也表明即使对于这些几乎相同的细菌而言竞争排斥也是无关紧要的。比较发展最快的核心基因（所有基因组变体中存在的基因）中同义和非同义突变的比率，发现多样化选择作用于775个基因，包括许多转运蛋白和参与细胞包膜生物发生的基因。并非在所有变异基因组上都编码的辅助基因和CRISPRs可能显示出更多与生态相关的差异，从而可能阻止竞争性排斥。图2苏打湖宏基因组组装基因组的相对丰度和多样性。Sunburst图显示了从卡里布湖获得的宏基因组组装基因组（MAGs）的相对丰度和GTDB分类学分类。 灰色显示中亚（库伦达）苏打湖MAGs中亲缘关系最近的核心微生物组MAGs。 红色轮廓线表示尚未在GTDB中显示的新进化枝。例如，MAG C1是最丰富的MAGs，隶属于GTDB中代表的Nodosilinea属。b散点图显示了每个核心微生物群，卡里布和库伦达代表之间的遗传距离是卡里布mats样品中丰度的函数。 这种关系在统计学上是有意义的（Pearson’s correlation r：−0.49，n = 48，p <0.05），但是对于库伦达MAGs的丰度却没有检测到这种关系。
3 蛋白质组学揭示了蓝细菌的生态位分配
人们已经清楚地了解了指示有效光养微生物垫群落组装的过程，具有生态适应性以及对动态光，氧气，硫化物，pH和二氧化碳梯度的响应。但是，这些已知的接触规则在大多程度上也适用于碱式苏打湖微生物垫，如以前对卡里布苏打湖所示，苏打湖的初级生产力可以获取无限量的无机碳？研究者进行了环境蛋白质组学研究并将蛋白质表达与大量MAGs关联，以回答卡里布Plateau苏打湖mats的这一问题。在每个湖泊的mats样品中都鉴定出了7000多种表达蛋白，而且一致性很高。相比之下，迄今为止获得的最全面的环境蛋白质组最多鉴定出约10,000种蛋白质。鉴于mats样品的高度多样性和极其复杂的性质，鉴定7217种蛋白质是生态生理解释的极佳起点。大约一半的表达蛋白可归因于91种MAGs，这与从扩增子和shotgun数据推断出的丰度估计值一致，这使研究者能够研究与MAGs相关的细菌如何根据不同的生态生理优先级分配其资源。考虑到大量的细胞能量用于制造蛋白质，专用于特定功能的蛋白质组的相对比例提供了该功能对生物的重要性的估计。蛋白质组学数据还用于估算某些丰富物种的13C含量，提供有关其使用哪种碳源以及碳的可利用性在多大程度上限制了其增长的其他信息。布雷迪（2013）等人先前揭示，微生物散布的有机物的δ13C值为−19至−25‰，与大量溶解的碳酸盐相比，在13C中耗竭的27‰，与非CO2限制的光合作用一致。根据蛋白质组学数据推断，四个湖泊的总蛋白质δ13C值在-19和-25‰之间，与先前有机质研究的结果相符。最丰富的细菌是与Nodosilinea和Phormidium有关的大型、垫状（丝状）蓝细菌，这与其生产性生态系统和可几乎无限制地获取无机碳一致。色素天线蛋白和光合作用反应中心蛋白在检测到的蛋白质中占最大比例。在宏蛋白质组中存在率最高的生物是蓝细菌MAG C1，其与Nodosilinea并存，最多占mats宏蛋白质组的42％。值得注意的是，研究者能够从这种MAG中鉴定出1103种蛋白质，占其预测蛋白质组的27％（图3）。此检测水平可与其他纯蓝藻培养物研究中的蛋白质组学结果相媲美，如节肢动物螺旋藻（Arthrospira）占21％，蓝藻菌蓝藻（Cyanothece）占47％。总共组装了九个蓝藻MAGs，并且在所有四个湖的宏蛋白质组中检测到了所有九种蓝藻中的蛋白质（图3）。很明显，大量蓝藻的存在提供了功能冗余，并有助于功能的稳健性和弹性。然而，研究者通过大量的蛋白质检测为蓝细菌，尤其是MAG C1（Nodosilinea）和MAG C5（Phormidium A）的蓝细菌的生态位分化提供了强有力的证据（图4）。图3苏打湖种群的代谢和蛋白质表达。热图显示了宏基因组组装基因组（MAGs）的丰度和表达的功能，其中在宏蛋白质组学中鉴定出至少15种蛋白质。MAGs根据功能进行分类，绿色的是自养生物，黄色的是厌氧菌，橙色是硫循环，棕色为其他异养细菌。如果在一个蛋白质组学中鉴定出该基因，则认为该基因已表达，并根据四个湖泊宏蛋白质组的最高相对丰度（占所有肽谱匹配的百分比）进行了阴影处理。如材料和方法中所述，估算了基因组和宏蛋白质组中的MAGs丰度。
藻胆体是蓝细菌的大型、蛋白质状的光捕获复合物，包含各种色素，这些色素在不同波长的光下吸收，并重新发射波长更长的光（约680 nm），与光系统II的反应中心兼容。在蓝藻种群中，藻胆色素的成分也有所不同，导致基于光质量的生态位分化，这也能在海洋环境中观察到。C1和大多数其他蓝细菌群体表达了大量的藻蓝蛋白，最大吸收值为620 nm，而藻蓝蛋白的最大吸收值为650 nm。相反，C5独特地表达色素藻红蛋白，在575 nm处具有最大吸光度（图4）。与蓝藻邻域相比，藻红蛋白可使该种群吸收更短的光波长，并扩展这些垫群落的光合作用的光谱范围，从而提高生产力。由于缺乏藻红蛋白的表达，其在495和560 nm处具有最大吸光度，这与具有高溶解性有机物的水生环境的光衰减曲线一致，例如生产性碱性湖中波长小于500 nm的光会迅速衰减。波长较短的光（蓝/绿光）具有较高的能量，而高能光子会损坏蓝细菌的光合作用机制。如果C5暴露于这些光子中，如其色素分布所展示的那样，则可能导致更多的光损伤。因此，该种群显示出更高的蛋白表达水平，例如硫氧还蛋白，以清除活性氧，橙色类胡萝卜素蛋白用于光保护（图4）。无机碳的固定和获取对于实现高初级生产力至关重要，并且相关的酶得到了高度表达。Calvin-Benson-Bassham循环（CBB）的限速酶RuBisCO约占蓝藻MAGs表达蛋白质组的1％，对于单个酶来说是很大一部分（图4）。相反，在蓝细菌中，碳浓缩机制（碳氢化合物吸收所需的碳浓缩机制）的表达差异很大。在C1和C8中，CCM蛋白占蛋白质组的比例不到0.2％。在C5中，CCM蛋白几乎占表达的蛋白质组的3％。C5是唯一能够表达比RuBisCO蛋白更高的CCM蛋白的种群，这表明该种群可能在某种程度上耗尽了其微环境中的碳酸氢盐。实际上，C5的δ13C值为-20.6±2.7‰，而C1为-25.2±0.8‰。光合作用过程中同位素分馏的减少通常与CO2（或碳酸氢盐）的限制有关。研究者可能会得出结论，C5获得更高的能量辐射会导致更高的光合作用速度，增加的氧气产量，对自由基保护的更高需求，更高的增长率以及对碳酸氢盐的主动导入。C5的相对丰度最高为2.3％，并非最丰富的蓝细菌，因此，如果C5具有较高的生长速率，则它也必须具有较高的衰减速率。这将使这种生物成为生态策略大师，将细胞生长优先于细胞保存。由于这些湖泊中溶解的碳酸氢盐浓度较高，碳酸氢盐不太可能持续限制生长。限制有时可能发生在厚mats上或雨雪融化后溶解的碳酸氢盐稀释后。图4在最丰富的丝状蓝细菌中的蛋白质表达。气泡图和Voronoi图比较了MAGs C1和C5的功能表达水平，两者均与丝状蓝细菌相关。Voronoi图中每种形状的面积与MAGs表达的蛋白质中蛋白质或子系统所占的百分比成比例。Voronoi图的配色方案与气泡图相同。气泡图中气泡的大小根据MAGs蛋白组中核糖体蛋白、翻译因子和蛋白伴侣的相对丰度进行了标准化。
4 蛋白质组学与低营养物含量一致
氮通常是全球苏打湖初级生产中的限制营养物质。卡里布高原湖泊的湖水中氨和硝酸盐的浓度很低或低于检测范围。同样，未检测到涉及氮损失过程的任何蛋白质（如硝化或反硝化）或同化硝酸盐还原酶或硝酸盐转运蛋白的表达。许多细菌，包括蓝细菌C1，C5和C8，都表达了氮固定过程中耗能较大的关键基因（图3）。所有的蓝细菌还表达了谷氨酰胺合成酶（用于在氮限制条件下吸收氨）和尿素转运蛋白。氮，尿素以及可能的氨显然是支持光合作用的主要氮源。不同细菌同时进行的氮固定功能提供了功能冗余，有助于功能的稳健性和弹性。磷酸盐也可能是苏打湖中的一种限制性营养素，本研究中的Deer湖似乎就是这种情况，在湖水中无法检测到磷酸盐。蓝细菌C8（Gloeocapsa）是Deer湖中最丰富的种群（占Deer湖元蛋白质组的12.9％）。与其他蓝细菌相比，其表达了更高水平（C8表达的蛋白质组的1.5％）的高亲和力磷酸盐转运系统。磷酸盐可能会限制Deer湖的初级生产，因为这里的产氧光异养生物比其他湖泊多4–40倍（图3）。5 湖垫上的营养养分的多样性
卡里布地区的微生物垫显示出陡峭的氧气和硫化物梯度，这为使用剩余光的光异养细菌提供了机会，这些光可以穿透蓝细菌产生的氧化层。Puf或Puh光系统反应中心蛋白由隶属于Rhodobacteraceae科的紫色非硫细菌、MAG A4、Geminicoccales，MAG A7、MAG G8以及隶属于Thiohalocapsa的自养紫色硫细菌所表达。在磷酸盐限制的Deer湖中，两种光异养菌都相对丰富，分别为3.2％和2.8％。除puhA外，MAG A4还表达了一氧化碳脱氢酶（coxSML）的全部三个亚基。一氧化碳可以通过有机材料的光氧化产生，并可以作为这些细菌的替代能源。支持光异养生长的有机底物可能包括蓝细菌发酵产物，光呼吸产生的乙醇酸盐或可能源自生物质的降解。通过利用光能重新同化有机物或固定碳酸氢盐，这些生物可以提高mats的整体生产率。在光异养生物中最出乎意料的是Ge1种群，这是最近定义的Gemmatimonadota门中一个未能培养的科的代表。该特定群体表达了光合作用反应中心的pufC亚基，并在其基因组中包含其余的光系统基因（pufLMA，puhA，acsF）。该门的成员利用光能的能力直到最近才被发现，而且光营养的能力似乎在该门的成员中普遍存在。Zheng及其同事分离出的Gemmatimonadetes细菌是异养的，没有碳固定途径的证据。有趣的是，完整的碳固定CBB循环所需的所有基因都存在于MAG Ge1的基因组中。鉴定出与功能性RuBisCO 1 C型大亚基（rbcL）和RuBisCO小亚基（rbcS）同源的基因，以及CBB周期特异性酶磷酸核糖激酶（prk）的基因。这些基因在基因组中依次排列：rbcS，rbcL和prk，该排列指向兼性自养。在对中亚库伦达草原苏打湖中已发表的MAGs进行进一步调查后，我们发现了另外5个Gemmatimonadetes MAGs（图5），这些MAGs编码这三个CBB周期基因，具有相同的同义性，并且对Ge1的基因具有88-98％的氨基酸同一性。所有已鉴定的rbcL基因均为功能性1型C rbcL序列（图5b）。据研究者所知，除这六个MAGs之外，没有其他来自Gemmatimonadetes门的测序代表包含完整的CBB循环基因。鉴于与变形杆菌（Alphaproteobacteria）中编码的同源基因共享大量氨基酸（> 90％）（例如，根瘤菌细菌YIM 77505 rbcL），这些芽孢杆菌属种群的最后祖先似乎是在进化和扩散进化枝到库伦达草原和Cariboo高原种群之前就已通过水平基因转移Alteproteobacterium获得相关基因。尽管从宏基因组学数据中进行基因组的组装和bin时会导致水平水平基因转移事件的人为推断，但从两个独立的数据集中检测六个不同MAGs中的六组系统发育一致的基因，似乎不太可能。研究者没有检测到这些基因的表达，也无法估计该细菌的δ13C值（高质量MS1光谱太少），因此仍不清楚该细菌使用碳酸氢盐作为碳源的程度。
图5 RuBisCO的侧向基因转移到光能自养的Gemmatimonadetes中。从公共数据库中的Gemmatimonadota MAGs获得的19个串联核糖体、RNA聚合酶基因、以及从卡里布湖（蓝色，Ge1-Ge5）获得的五种MAGs和从库伦达湖（橙色）获得的十六种的MAGs构建的最大似然系统树。苏打湖MAGs在GTDB令SG8-23中形成两个簇，其中第一簇包含先前从海洋栖息地中获取的几个簇。b 从Gemmatimonadota其中一簇中的MAGs上编码的RuBisCO Form 1的最大似然系统树。两棵树之间的一致性表明来自Alteproteobacteria的单个水平基因转移事件之后的垂直遗传。
6 在蛋白质组学中鉴定出的湖垫中的硫循环
隶属于Thiohalocapsa的自养紫色硫细菌G8的存在表明mats中存在具有活性的硫循环，这是基于之前在mats中检测到的硫化物所预期的。事实上，隶属于Desulfonatronum的MAG D1能表达aprAB、sat和dsrAB，表明至少有一部分硫化物在mats内部产生。而醇脱氢酶、甲酸酯脱氢酶和氢化酶的表达，表明它可氧化乙醇、甲酸酯和氢等化合物。这些物质可能来自蓝细菌的暗发酵或生物质的腐烂。D1产生的硫化物可被MAGs G8和G4再利用。G4表达了soxX、soxC、dsrA和fccB，表明硫化物通过sox途径和反向dsr途径进行氧化。在其他未成功binned的群体中，也检测到了sox和fcc的表达，这些群体与Alphaproteobacteria，Chromatiales和其他Gammaproteobacteria有关。总之，研究者使用宏蛋白质组学和宏基因组学来解决关于苏打湖垫微生物生态学的基本问题。获得了91个由基因组组装的基因组，并表明这些分类单元的一部分定义了一个核心微生物组，这是一组在空间（四个湖泊）和时间（4年）内所有样本中均存在的丰富细菌。结果表明，一个非常相似的群体在中亚苏打湖中独立聚集。在这些苏打湖地区发现的某些微生物基因组之间的相似性，就其巨大的物理分离而言令人难以置信，表明用于传播的载体通常无效。研究者还展示了蓝细菌之间的功能冗余和互补位的存在，并证明了K和r策略的共存。蓝藻C1丰富度最高，但根据表达和同位素特征，其生长速度比C5慢。C5的生长似乎足够快，偶尔会耗尽其周围的碳酸氢盐，这与目前在碱性苏打湖中无限地获取碳酸氢盐的例子不一致。光异养菌碳源的性质和来源（包括潜在的杂养菌种）是未来研究的一个令人兴奋的途径。提出的核心微生物组为设计高效的微生物生态系统提供了蓝图，可指导有效的生物技术进行二氧化碳转化。
