编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读新生儿感染时全世界婴儿死亡的常见原因，尤其是对于早产的婴儿。早发性败血症（EOS）常发生在产后3天内，主要由链球菌（GBS）或者在出生过程中感染大肠杆菌引起。虽然抗生素的使用降低了EOS的发生率，但是会增加LOS（迟发型败血症）的风险，可能与微生物组相关。有相关研究报道了早产儿和足月儿的微生物组存在差异，也有证据表明败血症可能源于肠道中微生物组的迁移。
本研究针对益生菌在临床上预防LOS发病的机制展开研究，结果表明：
1. 微生物组的成分有助于预防LOS，消除或丰富鼠李糖乳杆菌传播的母体抗生素暴露分别可以加剧和预防疾病。
2. 预防性地使用某些乳酸菌，具有保护作用。
本文建立了新生儿功能障碍和LOS之间的联系，并为合理选择可调节微生物组主要序列以预防疾病的益生菌提供了基础。
原名：Preventing dysbiosis of the neonatal mouse intestinal microbiome protects against late-onset sepsis
期刊：Nature Medicine
IF：30.641
发表时间：2019.11
通讯作者：Casey T. Weaver
本文首先过夜培养乳杆菌菌株和大肠杆菌菌株，收集过夜培养物，用无菌PBS稀释，测定生长曲线。将饲养的母鼠和幼鼠进行分组，随后一起饲养。用无菌LB过夜培养肺炎克雷菌，在新鲜LB中按1：50稀释之后培养至生长对数期。调整浓度至5×106-5×107CFU之间的浓度进行小鼠灌胃，在处理之前先进行乙醇处理，感染后6h使用IVIS Lumina成像系统进行动物成像处理。以肺炎克雷伯菌50μl的剂量感染小鼠，随后的10d跟踪幼鼠的生物发光信号和死亡率。随后将幼鼠从母鼠体内取出，用3-4%异氟烷对母鼠进行麻醉处理，进行腹部成像1-3min，检测到荧光便进行幼鼠处死，应用LivingImage软件分析图像，全身成像后，将幼鼠处死并取出器官进行离体成像。生物发光成像后，将肠和肠外器官转移至含有无菌PBS的油管中，将组织磨成匀浆后进行倍比稀释，平板计数后测定细菌数量。用小鼠巨噬细胞进行了细胞测定试验，流式细胞术分析巨噬细胞的生长情况。将幼鼠的肠组织转移至含有无菌PBS的预脱脂试管中，倍比稀释后菌落计数，分离单个菌落的菌株后进行16s RNA测序，结果进行blast比对。随后，提取肠组织的DNA，确保完整性后进行微生物组测序。小鼠粪便移植后进行肠道微生物的检测，分别进行基因组测序和宏基因组测序，最后进行肠道组织的定量PCR检测，取结肠进行免疫荧光检测和抗生素药敏试验。最后应用SPSS进行数据统计。为了模拟LOS，在胃内用肺炎克雷伯氏菌（ATCC，43816）感染5日龄的幼鼠，它可以发出绿色荧光，以实现对组织和组织学细菌进行成像。在无特定病原体（SPF）的条件下饲养的幼犬中，滴定的给药剂量可导致50％的死亡率（图1a）。使用活体动物成像，跟踪了Kp-43816lux的实时定居和传播（图1b，c）。离体组织发光与分离的肺炎克雷伯菌菌落形成单位（cfu）之间的密切相关性得到了证实（图1a，b），感染的主要部位位于盲肠和结肠，并在较小程度上位于远端小肠。在与Kp-43816lux和Kp-43816gfp共定殖后24小时，在化脓性幼崽的肝脏中发现了与生物发光成像相关的易位（图1d）和Kp-43816gfp，而无败血症的幼鼠的肝脏中没有发现（图1e）。因此，肠易位后，肺炎克雷伯菌病菌导致了LOS。Kp-39lux的定殖模式与Kp-43816lux相似（图1g），但每cfu的发光度更高（图1c）。在LOS发生之前和之后（分别为第1天和第3天），从通过淋巴扩散播种的肠系膜中回收的Kp-43816比Kp-39多。但是，在肝脏中发现的这两种菌株是通过血液接种的（图1h）。由于感染后第1天在肝脏和肠系膜中检测到Kp-39，因此，它可以移位但不会引起败血症。感染Kp-43816lux在24小时内死亡（图1i），这表明宿主清除率的差异导致了这些相关菌株的毒力差异。Kp-39的K10荚膜类型研究较少，但Kp-43816是一种产生超胶囊的K2菌株（图1j），对吞噬作用有抵抗力。因此，Kp-39gfp的体外吞噬效率是Kp-43816gfp的两倍（图1k）。结果显示，在没有足够的宿主清除率的情况下，易位细菌传播后，幼鼠营养不良会导致LOS。图1 当肺炎链球菌易位后未清除时，新生鼠菌群失调变为LOS
2 微生物组改变了对新生幼犬营养不良和对LOS的敏感性在无菌（GF）条件下饲养的没有微生物组的幼仔对Kp-43816lux介导的LOS易感，并且显示出比SPF对照更强的定植能力（图2a），表明新生儿微生物组已经在抑制病菌中发挥了作用。与SPF幼仔相比，庆大霉素处理的母犬对败血症的发展更敏感，而万古霉素处理的母犬（下称 “ vanc幼仔”）则较不易感染（图2b）。以低剂量Kp-43816lux体外腹腔感染抗生素的饲养和SPF幼仔（图2c），结果显示所有幼犬均在24小时内死于感染，仅在最初2小时内观察到定植差异。此外，万古霉素和庆大霉素均不影响Kp-43816lux的肠外清除率。与SPF对照相比，Kp-39lux感染导致庆大霉素处理的幼仔定植升高，而vanc幼仔较低的定植（图2d）。结论显示，母体抗生素暴露会改变遗传的微生物组，从而导致定植抗性的改变和对LOS的易感性。3 母体抗生素会改变围产期传播的乳杆菌群落，从而提供保护。随后，检测了庆大霉素、万古霉素或两者都不给药的母鼠所产的幼崽的肠中的16S rRNA序列（图3a）。初步分析表明，每个微生物组均由相对较少的生物体主导。对差异丰富的分类单元的无偏分析表明，抗生素的饲养主要影响了乳酸杆菌和杆状杆菌属的相对丰度（图3b）。雄性幼仔的微生物群具有相对丰富的轮状杆菌，而缺乏乳杆菌，而幼仔的微生物群具有较少的轮状杆菌和较大的乳杆菌。SPF幼仔落在由庆大霉素处理的幼仔和Vanc幼仔定义的范围内（图3a，b）；SPF微生物群与这两种幼仔的群落紧密隔离。总之，结果表明乳杆菌的存在与否与对新生幼仔营养不良和LOS的抵抗力和敏感性之间具有相关性。序列分析结果表明，序列数据与c.f.u有很好的相关性（图3c）。通过选择性培养分析列举。因此，给予庆大霉素减少了幼崽乳杆菌的数量，而万古霉素的施用却增加了乳杆菌的数量，杆状杆菌在各组之间保持不变，表明乳酸菌（LAB）的丰富性与针对肺炎克雷伯菌引起的LOS的保护之间存在联系。在富含内源性LAB菌株的条件下培养vanc幼仔的结肠内容物，然后在肺炎克雷伯氏菌攻击前将其施用给gent幼仔（图3d），结果显示内源性LAB菌株可以作为益生菌来提供针对新生儿营养不良的保护作用。所有分配给乳杆菌顺序的16S rRNA基因进行寡聚分析（图3e），将16S序列的多样性解析为8个寡聚体（图3e），结果显示无法通过16S分析得到完全证实（数据未显示）。抗生素治疗产生的菌种主要是由于鼠李糖乳杆菌的丰度变化所致，幼仔的微生物群主要由鼠李糖乳杆菌组成，而雄性幼仔的微生物群大部分没有鼠李糖乳杆菌（图3e）。使用鼠李糖乳杆菌（V10株）和约翰逊氏乳杆菌（G2A株）的肠道分离株，在胆汁存在下，两者均对庆大霉素敏感（图4a，d）。在庆大霉素剂量较高时，在有氧培养条件下对其敏感性增加（图4b，e）。单独的胆汁对厌氧或有氧环境中分离菌的生长没有影响（图4c，f），表明庆大霉素杀死了乳酸杆菌的保护性菌株，从而阻止了它们进入幼仔。为明确鼠李糖乳杆菌的起源，使用组合基因组学或宏基因组学方法（扩展数据图5a）对从对照和万古霉素处理的母犬及其幼崽收集的四十八株分离株进行鸟枪法测序和分类。结果显示，回收的分离株中有90％被鉴定为乳酸杆菌，其中58％为粘液乳杆菌（图5b），只从对照SPF仔猪检查的四只幼崽中的一只中培养出鼠李斯特菌。核心单核苷酸多态性（SNP）分析将所有三个分离株与来自相应母犬的两个阴道分离株紧密地聚在一起（扩展数据图5d）。万古霉素处理的母犬产出三只鼠李糖乳杆菌阳性的幼仔。结果证明从母犬到幼仔的垂直传播的三种情况（图5c），但不能解释第四个粘液乳杆菌阳性幼仔（图5d）。检测万古霉素处理的母犬和幼崽中核心SNP的分布，发现母犬具有一个以上的鼠李糖乳杆菌菌株，但传播了一个在幼崽之间有所不同的单一优势菌株（图5e）。粘液乳杆菌的保护性试验结果显示，万古霉素处理的幼鼠分离的鼠利斯特氏菌V10的Gent幼鼠表现出Kp-39lux的减弱的生长趋势（图3g），建立了有效的肠道益生菌作用。但不能推广到常用的益生菌如鼠李糖乳杆菌GG（LGG）和植物乳杆菌（ATCC，202195）或鼠李糖乳杆菌的参考菌株（ATCC，35020，图3g和图6）。另外，接受约翰逊氏菌G2A分离物的幼崽也得到了保护，但没有达到与鼠李糖乳杆菌V10相同的程度（图3g）。因此，不同乳酸杆菌属的益生菌活性差异很大，无法通过预防性处理后肠道中LAB的绝对定量或体外直接抑制肺炎克雷伯菌的生长来预测。5 以厌氧菌为主导的成熟微生物组可抵抗新生鼠的营养不良为了评估观察到的与年龄相关的保护是否需要微生物组，用Kp-43816lux对最近断奶的SPF或GF母鼠攻毒。尽管ASF小鼠的微生物群赋予了对肺炎克雷伯菌过度生长的某些早期抗性，但最终ASF和GF小鼠都死于感染（图4b）。另外，还检测了从出生到断奶的肠道微生物组，以定义其成分的变化。在生命的最初几天，当绝对丰度较低时，相对细菌丰度是异质的（图4c），随着年龄的增长而变得更加均匀（图4c）。图4 专性厌氧菌占主导地位的微生物群对LOS具有抗性
从P19供体向雄性幼仔的粪便微生物移植（FMT）显着降低了LOS（图5a）和营养不良（图5b）的发展。但是，用三丁酸甘油酯处理后直接补充丁酸酯不是保护性的，并且不诱导指示PPARγ激活的基因表达变化。此外，罗格列酮直接刺激PPARγ不会影响Kp-39lux的定殖（图10c，d）。结果表明，成年小鼠中限制腔内氧气的途径尚未在新生儿中起作用，并且暗示在FMT之后潜在的定植抗性的其他机制。为了确定专性厌氧菌是否可以移植到新生儿受体中，连续两天对同窝的P5 gent幼仔进行FMT（来自P19供体）或假手术治疗。FMT接受者的分析显示乳杆菌的相对丰度较低（图5c）。取而代之的是，FMT受体的微生物群主要由肠杆菌（图5c）所主导，几乎所有细菌都属于埃希氏菌属。因此，与由幼仔细菌介导的保护作用相反，P19 FMT赋予的保护作用得益于肠杆菌而不是乳杆菌。结果表明，多种细菌菌株可能赋予对可引起败血症的病原菌的定植抗性，强大的生态约束条件限制了早期专性厌氧菌的植入。图5 专性厌氧菌不能移植到易感的幼鼠体内，以保护其不受LOS和新生儿发育不良的影响
LOS与新生仔微生物组的改变有关。在本研究中，使用LOS模型确定了新生儿营养不良和败血症之间的因果关系，并定义了由抗生素引起的微生物群的特定变化，这些变化主要是由临床相关的肺炎克雷伯氏菌引起的营养不良。研究结果表明，微生物组的正常组成能够有效的阻止新生自肠道中病原体的增殖，以预防LOS。这为理解为什么某些益生菌具有保护性而另一些益生菌没有保护性提供了基础，对临床实践具有重要意义。早产仔中广谱抗生素的长期使用与LOS，坏死性小肠结肠炎（NEC）和死亡的风险增加有关。万古霉素和庆大霉素对LOS有相反影响的意外发现强调了在临床实践中更好地选择抗生素的重要性。经验性抗生素敏感性测试取决于实验室条件，因此当不考虑体内因素（例如胆汁）时是不可靠的。因此，可以通过考虑一种组合方法来改善临床抗生素的使用，该方法包括针对肠道菌群和体内测试以及基因评估的潜在抗生素活性，而不仅限于体外试验。尽管进行了十多年的临床试验，但缺乏对所用生物，剂量或方案的标准化方法限制了新生儿败血症中益生菌的使用。病原体的体外生长抑制不能预测体内功效。此外，尽管LGG可以有效预防小鼠和人体内抗生素引起的腹泻，但不能有效预防LOS。在临床试验中，通过使用植物乳杆菌和益生元低聚果糖的组合治疗可减轻新生儿败血症的发生，这可促进新生儿肠道的植入。尽管鼠李糖乳杆菌减轻了模型中的新生儿败血症，但这项临床试验中使用的植物乳杆菌和益生菌却没有。这些结果表明，益生菌的治疗功效高度依赖于生态环境。鉴于新生小鼠和早产儿肠道之间的相似性，该模型提供了对适当选择益生菌具有抗LOS临床疗效的重要见解的可能性。本研究强调的最重要的生态参数是肠内氧气。在几种炎症性肠病中，腔内氧水平升高是导致营养不良的主要原因。在成年小鼠中，共生专性厌氧菌和上皮细胞之间存在正反馈回路，以维持较低的腔内氧水平。丁酸和其他微生物发酵产物会上皮细胞发出信号，以促进β氧化，增加耗氧量并激活转录程序，从而进一步降低腔内氧气水平。抗生素或炎症破坏会增加腔内氧气，并导致营养不良或病原体毒力增加，这可以通过在成年小鼠中施用PPARγ激动剂，三丁酸甘油酯或梭状芽孢杆菌的益生菌菌株加以预防。在模型中，预防肺炎克雷伯菌定殖的类似方法无效，这表明该途径在未成熟的小鼠肠道中不起作用。鉴于新生小鼠和新生早产鼠分别缺乏发酵丁酸盐的厌氧菌和结肠或粪便丁酸盐，未成熟的肠道和发育中的肠道微生物组无法验证专性厌氧菌。即使低剂量的丁酸盐或三丁酸甘油酯也对新生小鼠有毒性（数据未显示）。另一方面，已经证明直接PPARγ激动在NEC53的小鼠模型中是有效的，需要进一步的研究来理解未成熟肠和成熟肠中上皮细胞代谢之间的差异，以此作为靶向宿主机制的基础，该机制会促进专性厌氧菌的移植以抵抗LOS。FMT中专性厌氧菌未能移植到新生儿肠道中。接受FMT的新生儿的微生物群迅速被兼性厌氧菌，尤其是大肠杆菌（供体微生物组的次要成分）所支配。尽管先前的研究支持微生物组本身在成熟小鼠中产生低氧张力方面的作用，但成年GF小鼠的肠道比新生儿更缺氧。此外，母乳中的饮食糖可能会影响正在发育的微生物，并可能导致缺乏对专性厌氧菌生长，需要进一步探讨。微生物组的组成和随年龄而变化的宿主因子与共生菌群无关，它们在确定腔内氧气水平方面起着重要作用。因此，尽管成年GF小鼠通常被用来模拟肠道微生物组的主要演替过程及其与宿主的相互作用，但成年小鼠肠道中专性厌氧菌的内在验证是这些小鼠在新生儿模型中使用的重要限制。在本研究模型中，乳酸菌在预防营养不良中并不是唯一的。大肠杆菌益生菌菌株获得的保护达到或超过了穆氏乳杆菌作为单一疗法所提供的保护。尽管最近有报道称，共生和益生性肠杆菌科通过竞争氧气改善了沙门氏菌感染，但本研究显示FMT导致了天然大肠杆菌菌株的移植，这些菌株在不降低肠道氧气水平的情况下具有保护作用。因此，除降低氧气张力外，其他机制还可以赋予抵抗力，使在新生鼠肠道中的病原菌过度生长，增加了独立的和潜在的协同作用机制的可能性，不同种类的细菌可能由于氧气减少或其他机制而协同预防LOS。早发型败血症（LOS）被认为是由于早产儿肠道中共生微生物的系统性扩散而引起的。由于疗效有限，益生菌在临床上用于预防LOS的方法有所不同，这反映出对肠道微生物组发育、新生儿营养不良和LOS之间关系的不完全了解。使用LOS模型，研究人员发现发展中的微生物组的成分对于预防LOS是必要的。消除或丰富了鼠李糖乳杆菌传播的母体抗生素暴露分别加剧和预防了疾病。预防性施用某些乳酸菌，具有保护作用。肠道氧气水平是菌群定居动态的主要驱动力，尽管其机制不同于成年鼠。结果表明建立了新生儿功能障碍和LOS之间的联系，并为合理选择可调节微生物组主要序列以预防疾病的益生菌提供了基础。新生儿感染是全世界婴儿死亡的常见原因，特别是对于早产的婴儿。较长的妊娠与肠道微生物组中专性厌氧菌的较早产后出现有关。考虑到营养不良和LOS之间的关联，本文应用LOS模型，发现发展中的微生物组的成分对于预防LOS是必要的。预防性施用某些乳酸菌，具有保护作用，结果建立了新生儿功能障碍和LOS之间的联系，并为合理选择可调节微生物组主要序列以预防疾病的益生菌提供了基础。
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