科研 | Microbiome：赭曲霉毒素A可影响肠道菌群从而诱发肝脏炎症(国人作品)

编译：LKXY，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

赭曲霉毒素A（OTA）是一类常见的天然食品污染物，作为一种真菌毒素，赭曲霉毒素A具有致癌、肝毒性、肾毒性等多种毒性作用。已有研究报道OTA能够破坏肠道屏障，OTA能够导致肝脏炎症损伤。但是OTA、肠道菌群、肝脏炎症三者之间的关系仍未得到证实。

在本研究中，研究者利用16SRNA测序、抗生素抑菌动物模型、粪菌移植等常见肠道菌群研究手段，证实了赭曲霉毒素A（OTA）能够改变盲肠菌群的组成，诱导拟杆菌增多，导致内毒素LPS产生增多，通过TLR4通路，促进肝脏炎症细胞增多，炎性细胞因子释放增多，最终导致肝脏炎症损伤的产生。

本文为OTA诱导型肝炎的机制提供了新的见解，为其治疗提供了新的思路。

论文ID

原名：Ochratoxin A induces liver inflammation: involvement of intestinal microbiota

译名：赭曲霉毒素A可诱发肝脏炎症:涉及肠道微生物群

期刊：Microbiome

IF：9.86

发表时间：2019.11

通讯作者：任文凯&杨琳

作者单位：华南农业大学动物科学学院

实验设计

结果

1 OTA灌胃处理改变了鸭子盲肠菌群的组成，促进盲肠部位LPS合成

为了探讨OTA对肠道菌群的影响，通过进行16sRNA和宏基因组测序，PCA分析显示对照组鸭子盲肠菌群与OTA组鸭子盲肠菌群明显区别(图1a)，说明OTA能够明显改变盲肠菌群构成。宏基因组学分析结果显示，OTA增加了LPS生物合成相关基因和基因家族的丰度(P < 0.01，图1b)。通过宏基因组测序分析不同菌株对LPS生物合成的贡献能力，发现拟杆菌对LPS生物合成的贡献最大(图1c)。值得注意的是，OTA组的普通拟杆菌相对丰度高于CON组(图1d)。我们测定了盲肠部LPS水平，与未经过OTA处理的鸭子相比，经OTA处理的鸭子的盲肠LPS水平要高出1.5倍(图1e)。这些结果说明OTA能够诱导肠道菌群的失调，特别是导致产生脂多糖的拟杆菌增加。

图1 OTA灌胃后，鸭子盲肠菌群及宏基因组功能分析。

2 OTA改变了鸭子肝脏中的微生物群

以往的研究中提示OTA可增强盲肠通透性，基于这些结果，我们假设产生脂多糖的拟杆菌在OTA处理后可能通过渗漏的肠道进入肝脏。为了探索这种可能性，我们分析了肝脏中的微生物群。PCA分析显示CON组和OTA组肝脏微生物群存在差异(图2a)。OTA在门水平、属水平、种水平都显著增加了拟杆菌的相对丰度 (图2 b)。有趣的是，我们还发现OTA处理后显著提高了鸭子肝脏的LPS水平(图2c)。总的来说，OTA增加了肝脏中产生LPS的拟杆菌的相对丰度和鸭子肝脏中LPS的水平。

图2 OTA处理后，鸭子肝脏菌群的构成。

3 口服 OTA促进肝脏炎症进展

我们分别分析了对照组和OTA处理组肝脏的炎症反应变化。OTA处理后，TLR4 信号通路中的TLR4, Myd88等mRNA转录表达增高，蛋白丰度增加(图3 a、b)。OTA还促进了炎性细胞因子的mRNA表达和分泌,包括IL-1β和Il - 6(图3 a、c)。值得注意的是, OTA处理后，抗炎细胞因子IL - 10的水平降低 (图3 c)。组织学分析还表明,OTA诱导肝脏炎症的发生基于大量的炎性细胞浸润 (图3 d, e)。OTA处理组血清AST、ALT和血清LPS水平的增加都表明肝脏炎症的进展。总的来说,OTA促进了鸭子体内肝炎的进展。

图3 OTA促进肝脏炎症。

4 OTA对抗生素治疗后的鸭子盲肠菌群的影响有限

我们发现OTA可诱导鸭肠道菌群失调和肝脏炎症;因此，我们推测OTA通过肠道菌群促进肝脏炎症。我们用链霉素、氨苄西林、新霉素等抗生素混合治疗清除肠道菌群。PCA分析显示，两组鸭子盲肠菌群相似(图4a)， OTA对盲肠细菌在门、属、种水平上的组成影响不大(图4b，4c)。同样，OTA对盲肠LPS水平影响不大(图4d)。结果表明，OTA对抗生素处理组的鸭子盲肠菌群影响不大。

图4 抗生素治疗后，OTA对盲肠菌群及LPS的作用有限。

5 对于接受抗生素治疗的鸭子，OTA不能有效促进肝脏炎症发生

经抗生素处理的鸭子口服OTA后，肝脏的LPS水平和肝脏炎症反应指标(包括TLR4和Myd88的mRNA表达、炎症细胞因子的分泌和炎症细胞的浸润)变化甚微(图5a-e)。OTA对抗生素治疗组的血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性、血清脂多糖(LPS)和炎性细胞因子(图 5f-h)的影响也较小。总之，OTA不能促进经抗生素治疗的鸭子的肝脏炎症发生。

图5 抗生素治疗后，OTA不再促进鸭子肝脏炎症发生

6 OTA诱导的肠菌变化促进了肝脏炎症

为了进一步探讨肠道菌群在OTA促进肝炎发生中的作用，我们将鸭子随机分为对照组，OTA处理组，粪菌移植对照组（FMT），粪菌移植联合OTA处理组（FMT+OTA）。FMT组接受了来源于OTA处理后的鸭子的粪菌，粪菌移植后其肝脏LPS水平，肝脏炎性指标（包括TLR4，TNF-α的mRNA表达，TLR4，Myd88， p-p65的蛋白丰度，p-IKBα/ IKBα比值，IL-1β和Il - 6的分泌和炎性细胞浸润）都显著增高。来源于OTA处理组的粪菌还增强了鸭子血清中LPS和TNF-α的水平。这些结果说明了OTA诱导的变化的肠菌促进了肝脏炎症。

图6 粪菌移植后鸭子的肠道菌群构成和LPS水平。

图7 OTA诱导的肠菌变化促进了肝脏炎症。

讨论

OTA是一种主要的食物污染真菌毒素，表现出肾毒性、肝毒性、致畸性、免疫毒性和致癌性。肠道菌群是环境物质与宿主健康之间的重要桥梁。事实上，肠道菌群除了维持胃肠道稳态的重要作用外，还影响其他内脏器官(如脑、肝、肺)的众多生理功能，并参与介导这些器官不同疾病的发病机制。尽管先前的调查表明,OTA降低了相对丰富的有益微生物(如乳酸菌和双歧杆菌),肠道菌群构成的多样性,并增加了大鼠粪便中兼性厌氧菌的总量，然而OTA是否通过肠道菌群导致肠外器官损伤(如肝脏和肾脏)还有待揭示。

我们发现OTA改变了鸭子的肠道菌群组成，包括丰度和多样性的减少，厚壁菌门、拟杆菌门的相对丰度的增加。拟杆菌属的相对丰度在正常鸭体内占32.69%，OTA处理后达到52.99%。有研究表明，拟杆菌属作为革兰阴性菌，其部分菌株如Bacteroides fragilis, Bacteroides vulgatus, and Bacteroides dorei，常常与腹部感染、代谢性疾病和炎症相关。LPS是革兰氏阴性菌的主要致病成分。LPS或异位菌群，会通过激活病原相关模式识别受体导致炎症，包括TLR4，NF-κB等。肠道屏障的渗透导致肠道菌群及肠道菌群来源产物（LPS等）透过粘膜，转移到肝脏，引起炎症和肝损伤。在这项研究中，我们发现OTA会引起肠道屏障功能障碍，随后增加体循环LPS水平和鸭子肝脏中的炎症反应。同时研究显示，革兰阴性菌更容易穿透肠道屏障。在肠道菌群中占据主要地位的拟杆菌属，在OTA组的肝脏菌群中同样占主导地位，这提示肝脏菌群可能来自于肠道渗漏。本研究发现，OTA增加了LPS合成相关的基因和基因家族的相对丰度。且LPS合成与拟杆菌呈正相关。

有趣的是，在本研究中，我们还发现OTA处理会增加鸭子的肝脏重量。可能的解释包括:

(1)OTA作为主要靶器官，导致肝细胞过度增殖、肿胀和充血。

(2) OTA诱导肝脏结缔组织代偿性增加。

(3) OTA在炎症过程中诱导免疫细胞浸润。

值得注意的是，OTA对经抗生素处理的鸭子的盲肠、血清和肝脏中LPS的积累、TLR4信号通路的激活以及肝脏炎症反应几乎没有影响。此外，为了探究炎症所起的作用，我们进行了粪便微生物移植(FMT)实验，在相似的遗传背景下，粪菌移植为阐明肠道菌群在宿主防御机制中的作用提供了一个很好的途径。先前的研究也表明，FMT在改变代谢表型、治疗疾病和影响宿主免疫状态方面有很高的成功率。本研究中接受OTA处理组鸭子的粪便菌群移植的鸭子与OTA处理过的鸭子表现出相似的表型(盲肠菌群组成、盲肠脂多糖、肠道通透性和肝脏炎症)。基于这些结果，我们得出结论，肠道微生物群，特别是产生脂多糖的拟杆菌群，是导致肝脏炎症的原因之一。此外,OTA诱发的其他器官疾病(如脑、肾损伤)的发病机制是否依赖于肠道菌群，或OTA是否直接或间接通过肠道菌群影响肝脏生物合成(如总蛋白和凝血酶原)和代谢(如脂质代谢)能力等问题同样值得我们进一步去探讨。

结论

总的来说，本文发现了一种新的机制，将肠道菌群与赭曲霉毒素A诱导的肝脏炎症联系起来。OTA改变了盲肠菌群的多样性和组成，导致革兰氏阴性菌源性LPS增加，并通过有缺陷的肠道屏障进入血液和肝脏，最终促进鸭子肝脏炎症的发生。

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