科研 | Microbiome：生态位分化而非生物地理学决定了攀枝花苏铁微生物群落的多样性和组成(国人作品)

编译：独世，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

由于苏铁可以适应养分贫瘠和干旱的土壤环境，因此它们是研究植物与微生物组相互作用的重要模型。苏铁中很可能存在重要的有益微生物库，这些微生物可能有利于苏铁的生存。然而，与不同植物部位以及苏铁物种的根际土壤相关的微生物组的多样性和群落组成尚未进行全面研究。

本研究采用高通量测序技术，对攀枝花苏铁的根、种子、未受精种子、胚珠、花粉以及土壤中的细菌和真菌微生物群的物种多样性和群落组成进行了调查研究。通过多种生物信息学方法来探究此苏铁属物种不同样本类型之间的生态位特异性效应和生物地理因子。

结果表明，攀枝花不同部位的微生物群落结构出现了显著分化，表现出高度多样化的微生物群，且存在其独特的核心微生物类群，其中共有的微生物类群为假单胞菌科和丛赤壳科。就苏铁的地理而言，优势指示类群几乎未出现分化。土壤的细菌群落与其他五种植物器官之间存在显著的差异。与先前的调查相反，本研究中生物地理学几乎与微生物群落的分化无关。此外，攀枝花中主要存在两种传播模式。与苏铁相关的大多数微生物是从土壤或空气环境中横向衍生而来的，其余的则是通过种子从母本植物中垂直遗传的。这项研究为揭示不同植物部位和土壤之间的植物-微生物组相互作用提供了丰富的见解，并为研究苏铁在干旱和养分贫瘠的土壤环境中的适应机制及其进化保护提供了一定的理论指导。

论文ID

原名：Niche differentiation rather than biogeography shapes the diversity and composition of microbiome of Cycas panzhihuaensis

译名：生态位分化而非生物地理学决定了攀枝花苏铁微生物群落的多样性和组成

期刊：Microbiome

IF：10.465

发表时间：2019.12

通讯作者：龚洵

作者单位：中国科学院昆明植物研究所

实验设计

本文选择了两个健康的攀枝花种群进行采样：2016年7月至2016年9月于中国云南昆明植物园（KM）的人工栽培种群采集了花粉，胚珠，种子，未受精种子，珊瑚状根和附着的根际土壤；2016年9月10日于中国四川攀枝花国家级自然保护区（PZH）采集了种子，珊瑚状根和根际土壤。从KM和PZH中分别选取了10株和7株健康的攀枝花。每种样本类型收集四个样本，同时避免交叉污染。针对细菌16S rRNA基因的V4-V5高变区进行扩增，通过Illumina MiSeq进行测序。对下机测序数据进行样本分装、去嵌合体和质量筛选后，最终选取来自两个种群的32个样本（来自KM的22个样本和来自PZH的10个样本）并使用Qiime和R进行了下游分析。采用多种生信方法，探究了植物不同部位的优势微生物群和指示物种的组成，并确定了驱动群落组成的主要因素以及不同部位之间的微生物群落差异。

结果

1 微生物α多样性及群落组成

我们分析了每个样本中的微生物α多样性，包括辛普森逆多样性指数、OTU丰富度和Pielou均匀度（图1）。Turkey多重比较证实土壤细菌α多样性与其他5种植物器官存在显著差异（P < 0.001），而植物器官之间的细菌α多样性并不存在显著差异（图1a-f）。对于基于16S rRNA细菌数据集估算的辛普森逆多样性指数，我们在土壤样本中观察到了最高值（KM：154，PZH：45.8），而其他5个植物部位的辛普森逆多样性指数菌小于10.2（图1a，b）。同样我们在土壤样本中检测到较高的OTU丰富度（KM：1220，PZH：898），其他5个植物部位OTU丰富度均低于350（图1c，d）。胚珠和花粉的OTU丰富度存在显著差异（P< 0.05）。与植物部位样本相比，土壤样本的均匀度更高（KM：0.822，PZH：0.746），胚珠最低（0.087）（图2e，f）。此外，KM胚珠和根、未受精种子和根、胚珠和花粉、种子和胚珠以及种子和未受精种子之间也表现出显著的多样性差异（P< 0.05）。然而，我们并未在各类型样本中观察到显著的真菌α多样性差异（图1g-i）。

图1 人工栽培（a，c，e，g，i，k）和自然栖息地（b，d，f，h，j，l）中与苏铁相关微生物群落的α多样性指数：细菌α多样性（a–f），真菌α多样性（g–i）。其中，辛普森逆多样性指数（a，b，g，h），OTU丰富度（c，d，i，j），Pielou均匀度（e，f，k，l）

2 微生物β多样性

我们在科水平上检索了169个细菌科（占90.25％的序列）和105个真菌科（占55.92％的序列）。而在更低的生物分类等级中，只有49.25％的细菌序列和31.88％的真菌序列被分配到属水平。因此，我们选择在科水平和OTU水平上对微生物β多样性进行了评估。主成分分析（PCA）结果表明，土壤和不同植物部位的细菌群落之间在OTU和科水平上均存在显著的聚类效果（图2a-d），但真菌群落并非如此（图2e–h）。基于OTU水平，两个采样位点（KM和PZH）的土壤细菌群落组成与其他5个植物部位存在显著差异（图2a，b）。与胚珠，花粉和未受精的种子相比，KM种子和根的细菌群落结构已经出现出一定程度的分化（图2a），FZH种子和根的细菌群落结构也出现分化（图2b）。基于科水平，两个采样位点（KM和PZH）的土壤与其他5个植物部位的细菌群落组成存在显著差异（图2a，c）。不同的是，KM花粉和根的细菌群落结构与胚珠、种子和未受精的种子相比存在一定的差异，而FZH种子和根的细菌群落结构并不存在显著差异。

图2 主成分分析攀枝花苏铁不同样本类型基于OTU（a，b，e，f）和科（c，d，g，h）水平的微生物群落组成：KM（a，c）和PZH（b，d）的细菌群落组成，KM（e，g）和PZH（f，h）的真菌群落组成。

基于16SrRNA数据集的HCA和热图结果（图4a–d）清楚地揭示了两个聚类，一个聚类为土壤样本，另一个聚类包含来自植物部位的样本。在植物部位样本中，聚类结果与它们各自实际的植物部位并不完全匹配。KM根样本聚集在一起并与地上的植物部位样本区分开（图4a）。胚珠、花粉、未受精的种子和种子聚集在一起，无法在OTU水平单独区分。然而，根样品与地上的植物部位样本在科水平却无法区分开（图4b）。PZH不同样本类型在科水平（图4d）的聚类与它们各自实际的植物部位完全匹配，但在OTU水平并非如此（图4c）。土壤样品显著不同于种子和根样品。然而，与土壤和种子相比，PZH根微生物群落表现出一定程度的分化，但在真菌群落中并未观察到清晰的聚类结构（图4e–h）。

图4 基于OTU（a，c，e，g）和科（b，d，f，h）水平的攀枝花不同样本类型之间的层次聚类分析（HCA）和热图分析：HCA（左）和热图（右）的结果分别基于16S rRNA序列（a–d）和ITS序列（e–h），该序列来自KM（a，b，e，f）和PZH（c，d，g，h）。

3 不同植物部位的优势微生物群

本研究中鉴定出了KM的23个核心细菌科（图3a）和14个核心真菌科（图3c）以及PZH的18个核心细菌科（图3b）和9个核心真菌科（图3d）。大多数微生物科水平的丰度在不同植物部位存在显著差异（P< 0.05）。在种子样本中，KM中最丰富的细菌科是柄杆菌科（31.20％），而在PZH中是伯克氏菌科（32.34％）。然而，这两个细菌科在不同样本之间没有显著差异。我们还发现肠杆菌科（23.09％）和假单胞菌科（15.68％）显著富集在KM种子样本中。与PZH的根和土壤样本相比，假单孢菌科（26.15％）也显著富集在种子样本中。肠杆菌科（61.41％）显著富集在未受精的种子样本中（P< 0.05），其次是微杆菌科（28.21％）。在胚珠样本中观察到来自肠杆菌科的序列的相对丰度高达96.75％。与上述结果不同的是，丛毛单胞菌科（33.24％）和葡萄球菌科（20.25％）在花粉样本中占主导地位，且丛毛单胞菌科的丰度显著高于其他五种样本（P< 0.05）。假单胞菌科在KM根样本中显著富集（P< 0.05），相对丰度为51.10％。然而，PZH的根样本中主要的细菌科是束丝放线菌科（21.86％），其次是假诺卡氏菌科（15.70％）和红螺菌科（14.44％）。在PZH的种子、根和土壤样本中发现了红螺菌科丰度的显著变化（P< 0.05）。土壤样本的大多数序列是未知的，其中KM占28.77％，PZH占32.05％。盖氏菌科作为KM和PZH样本唯一共有的科，其在土壤样本中的相对丰度较小（KM为7.91％，PZH为10％）。

KM的种子（34.31％），胚珠（45.06％），花粉（23.40％），根（83.40％）和土壤（41.25％）样本中的丛赤壳科极其丰富。与其他植物部位样本相比，未未分类真菌（23.16％）在受精的种子样本中具有显著较高的相对丰度（P< 0.05）。发菌科的相对丰度在样本类型之间发生显著变化（P< 0.05）。然而，该科的相对丰度非常低，在花粉样品中观察到的最大丰度为4.11%。与根（0.31％）相比，PZH种子（13.42％）和土壤（33.89％）中的丛赤壳科显著富集（P< 0.05）。根样本中的未分类真菌丰度很高，达到19.72％。

图3 攀枝花苏铁不同部位核心微生物科的分布：KM的核心细菌科（a），PZH的核心细菌科（b），KM的核心真菌科（c），PZH核心真菌科（d）。

4 指示物种分析

KM样本中普遍存在假诺卡氏菌科，生丝微菌科，红螺菌科，丛毛单胞菌科，华杆菌科和肠杆菌科。与KM样本相比，我们并没有在PZH中检测到噬几丁质杆菌科，盐硫杆状菌科和莫拉菌科。所有样本类型中均存在两个真菌科：丛赤壳科和肉座菌科。种子样本的细菌指示物种由肠杆菌科（指示值= 0.679，P = 0.018）主导，而根样本则由假诺卡氏菌科（指示值= 0.856，P = 0.001）主导。KM土壤主要存在生丝微菌科（指标值=0.786，P = 0.007），而PZH土壤的细菌主要指示物种是芽孢杆菌科（指标值= 0.785，P = 0.002）。此外，种子，根和土壤的主要对于真菌指示物种是丛赤壳科（指标值= 0.778，P = 0.001），而PZH根的真菌指示物种由发菌科主导，尽管其相对丰度较低（4.66％）。

5. 维恩图比较

为了了解植物不同部位中OTU的分布情况，我们计算了每种样品类型中特有的OTU数量以及共享的OTU。KM样品中总共产生了2728个细菌OTU，六种样本组之间共享了1.14％的细菌OTU（图5a）。五个植物器官中共享OTU约占总OTU的0.51%，而土壤样品中特有的OTU占39.77％，而花粉（11.55％），根（4.58％），种子（4.40％），未受精的种子（2.31％）和胚珠样品（0.81％）特有的OTU占比较少。我们还发现土壤和根的OTU高度重叠（12.46％）。PZH样品中总共产生了2092个细菌OTU，三种样本类型中共享OTU约占总OTU的6.31%（图5b），其中土壤样本特有的OTU占36.38％，种子占20.41％，根样本占11.47％。

然而，从KM样品中检测到的665个真菌OTU，植物不同部位之间共享了3.76％的OTU（图5c）。与花粉（57），胚珠（51），未受精种子（49），种子（25）和根（9）相比，在土壤中鉴定出了58个特有的OTU（图5d）。PZH样品中检测到了438个真菌OTU，三种样本类型之间共享了约7.76％的OTU，种子和根样本中分别存在存在117、109个特有的OTU，而土壤样本中仅存在80个特有的OTU。

图5 维恩图显示攀枝花苏铁不同部位相关的微生物组在OTU水平上的重叠情况：KM（a）和PZH（b）的细菌OTU（a，b），（KM）和PZH（d）的真菌OTU（c，d）

讨论

攀枝花苏铁的每个部位代表了微生物组的独特生态位

正如稀释度曲线和α多样性指数所示，土壤和植物器官之间的物种多样性存在显著差异，这符合微生物定殖的观点。土壤作为地球上最丰富的微生物生态系统之一，为各种微生物谱系提供了理想的栖息地。据估计，0.5 g土壤中细菌多样性高达2000多种。然而，植物部位（内生植物）或附着在样品表面（附生植物）的物种多样性取要低得多，主要是由于以下因素：一方面，植物组织中微生物定殖和稳定群落的形成过程是高度可变的，并且比预期的更为复杂，受到许多生物和非生物因素的制约，例如宿主植物的先天免疫系统及其对微生物定殖的响应；另一方面，即使微生物成功入侵，植物也有将微环境容纳在组织中的能力，包括有限的细胞间空间，不均匀的营养分配再加上不均匀的温度和湿度。从土壤到植物组织（尤其是胚珠和未受精的种子），物种多样性出现大幅度地减少，这表明只有有限数量的细菌微生物才能与寄主植物保持共生的生活方式（丧失多样性和丰富性）并最终成为优势的内生组分（失去均匀性）。

无论是在OTU水平还是在科水平，PCA，HCA和热图分析均揭示了土壤和植物部位之间的细菌群落结构存在显著差异，而植物部位间的群落结构差异并不显著，且不同样本类型之间的真菌群落结果没有出现分化。如前所述，土壤中的微生物群可以作为微生物库进行补充，根微生物群通过从土壤微生物中水平传播得到大量更新。对于地上的植物组织，可能存在两种类型的微生物源，即来自大气的水平传播和通过种子的垂直传播。生态位的分化，尤其是土壤和植物组织之间的分化，引起了细菌微生物群落结构的变化。然而，这种变化并没有出现在真菌群落结构中。其他学者在模式株杨树和拟南芥以及非模式株龙舌兰、仙人掌以及其他植物中也发现了相似的结果。系统发育谱表明，龙舌兰植物中真菌微生物组的关键驱动因素是宿主的生物地理学，而细菌微生物组主要受植物不同组织影响。每个植物微环境或生态位都提供相关的生物和非生物梯度，例如可溶性有机化合物和氧气的利用率。与根际土壤相比，不同植物组织之间的生态位特定细菌类群非常相似。然而，栖息地独有的特征（即气候和土壤类型）很可能驱动着与植物相关真菌群落的不同组合，其根据地点的不同而存在一定程度的功能冗余。

不同栖息地（KM vs. PZH）的微生物组间出现一定程度分化

指示物种分析表明，苏铁的优势微生物群落在地理上几乎没有分化，但我们发现了宿主生态位特定的细菌类群。众所周知，一系列环境和宿主相关因素共同影响宿主植物的微生物，例如气候，土壤类型，植物基因型及其生物地理。然而，驱动细菌和真菌群落的因素在一定程度上有所不同。研究表明，与龙舌兰相关的细菌群落主要受植物部位或样品类型的影响，其根际土壤，根和叶内圈之间的细菌群落显著不同，而真菌群落随宿主的地理距离而变化。

在这项研究中，PZH（自然栖息地）的气候条件以干燥和炎热的天气为特征，年平均温度为21°C，年降水量达800mm。KM（人工栽培栖息地）的天气特征更为宜人，具有温暖和潮湿的条件，年平均气温约为15.09°C，年降水量约为994.69mm。气候条件的变化以及土壤性质、耕种方法可能导致了当地微生物群落的分化，从而形成了独特而高度多样化的土壤细菌群落。然而，受其传播能力的限制，真菌特有种群可能在多种规模和多种生境的群落构建中发挥作用。有趣的是，尽管发菌科的相对丰度较低（4.66％），但其相对丰度在不同样本类型之间发生了显著变化。丛赤壳科和发菌科都属于子囊菌门的粪壳菌纲的肉座菌目。这两个科的物种是常见的植物内生菌，有益于植物的健康。苏铁很可能选择了真菌微生物群的功能类群而不是组分类群。我们认为攀枝花微生物群落在自然栖息地和人工栽培栖息地之间的微小差异可能反映了一定程度的微生物保护，这些微生物保存受宿主选择调控。

攀枝花苏铁的细菌核心微生物群存在生态位偏好

植物有机体内的每个生态位以及土壤代表了细菌群落的独特生境。植物宿主特有的性状，包括内部组织结构、理化特性、特定的代谢途径和遗传产物，促进了与生态位类型相对应的细菌谱系的分化。根据核心细菌微生物组分析，种子样本的核心微生物群主要由柄杆菌科和肠杆菌科主导，其中肠杆菌科也是未受精种子和胚珠的关键科。花粉样品的主要成员是毛单胞菌科，根部的核心细菌微生物组主要是假诺卡氏菌科和生丝微菌科。种子、未受精种子和胚珠样品之间细菌群落的相似性可以通过以下事实来解释：这三个植物器官是母系起源的，并共享一些遗传物质；这三种样本类型共享的核心细菌群落，尤其是优势类群很可能是垂直传播的，并且在一定程度上显示出物种的保守性；宿主特异性或生态位分化可能对不同部位存在的优势菌株发挥更强大的作用。

然而，对于核心真菌群落而言，六种样本类型中的五种样本均以丛赤壳科为主导（除未受精的种子外），这表明植物生态位对真菌群落的分化并无影响。不同样品类型之间核心真菌群落的相似性验证了先前的结果，即植物生态位在真菌群落组合中没有发挥重要的作用，这可能涉及植物相关真菌微生物群的进化保守性。

攀枝花苏铁微生物群的起源与传播方式

植物中微生物群落的起源和传播方式有两种不同的途径：水平和垂直传播途径。大多数与植物相关的微生物群是从土壤微生物中水平转移的。首先，宿主植物在根际中产生的根际沉积和根系分泌物促使趋化作用，诱导土壤和/或根际微生物群落突破根系表面障碍并栖息于根系内部。进入根部后，微生物从植物的地下部分系统地转移到地上部分，最后到达生殖器官和种子微生物组。其遍及整个植物组织主要通过两个途径：一是在鞭毛和植物蒸腾流的帮助下穿过宿主植物的根木质部导管；另一种途径是通过分泌细胞壁降解酶来利用营养丰富的细胞间空间。然而，种子微生物组并非仅来自土壤，茎表面、叶表面、花表面和果实表面都被认为是种子/植物微生物组的替代来源。植物组织内部的微生物群可以通过菌丝索和合点从母本植物转移到种子的胚乳中，也可以通过珠孔转移到种子中。此外，微生物可以与松树的配子（即花粉）关联，通过胚珠的授粉，从而促进微生物在胚胎和胚乳的定殖。通常，微生物从土壤/空气传播到各种植物组织中微环境的传统途径包括：从不同组织的表皮和子房壁渗透；通过导管系统侵入；通过柱头内的花粉萌发进入胚珠。

从种子到幼苗的垂直传播过程在不同的植物类群中经常被报道，尤其是草，关于其传播效率尚有争议。种子携带的微生物有助于种子发芽、幼苗生长、促进植物生长和健康。种子内生菌感染下一代主要通过两种途径：离开种子，重新进入植物表面；留在种子内部，并随着幼苗的生长扩散到不同的植物组织中。然而，垂直传播过程中微生物在植物生长中所有可能的阶段都会出现损耗。换句话说，下一代将只保留一小部分垂直传播的微生物。

水平和垂直传播途径都可能存在于攀枝花苏铁中。PCA和HCA的结果表明，土壤微生物组的群落组成与其他五个植物部位存在显著差异。我们在植物部位中已经发现了生态位特有的细菌群落。考虑到物种多样性，土壤样品中的香农多样性指数最高，其次是种子、胚珠，未受精的种子中香农多样性指数最低。这一结果并非出乎意料，可以用以下事实来解释：土壤具有地球生态系统中最高的细菌多样性。尽管根是土壤微生物群落入侵植物组织的第一种媒介，并且许多研究已经确定了根中微生物物种的多样性和丰富性，但我们在攀枝花苏铁的种子中比根观察到了更高的物种多样性。不同微生物源的存在增加了种子中细菌总数。其他研究发现花粉的细菌多样性比胚珠高，部分原因是花粉的体积小，因此灭菌过程不彻底。此外，苏铁是异花授粉植物，花粉中检测到的微生物还可能包括来自空气颗粒或传粉媒介的细菌。花粉中检测到的微生物还可能包括来自空气颗粒或传粉媒介的细菌。未受精的种子表现出与胚珠相似的物种多样性水平，显著低于其他四种样品类型。胚珠抵抗各种蛋白质提供的外源微生物的保护机制可能是造成这种现象的原因。

不同部位的核心细菌组合和微生物群指示物种之间的大量重叠表明，某些细菌类群保留了内生能力以及处理生态位特异的植物环境。本研究中通过维恩图确定的常见物种可能来源于土壤的水平传播，并在传播过程中保留在每种样品类型中。或者，它们也有可能从种子中垂直继承。然而，这项研究无法确定已鉴别类群的确切传播方式，需要进一步的研究。

攀枝花苏铁优势菌群的潜在生态功能

指示物种和攀枝花苏铁核心微生物组分析指出了某些微生物群存在物种共存现象，因此本节将讨论这些重要物种的潜在生态作用。在已鉴定的细菌物种中，葡萄细菌性疫病菌是丰度最高的菌株，仅存在于花粉和土壤中。我们在攀枝花苏铁每个组织中发现少量的争论贪噬菌，其已被证实可以促进各种植物生长，例如花烛，大豆和甜菜。争论贪噬菌通过增强植物的抗病性和胁迫耐受性，提高养分利用率和同化作用，从而使植物受益。其中一部分菌株能够积聚稀土元素，从而降低其浓度。最主要的真菌种类是茄腐皮镰刀菌，主要存在于土壤和胚珠样本中。木贼镰刀菌在攀枝花苏铁各部位中相对丰度较高，这些微生物是谷物和其他植物中天然存在的内生菌，且对红豆草无致病性。内生木贼镰刀菌常作为有效的生物防治剂，治疗番茄和豌豆的根腐病，刺激植物生长。鉴于攀枝花苏铁生存环境存在干旱和一些恶劣条件的自然特征，与苏铁相关的微生物可能通过补充养分，提高植物病原体抗性和胁迫耐受性从而促进宿主生长和环境适应。

与植物相关的微生物群赋予植物对生物胁迫的抗性，并提高植物的生长和健康。由于对干旱和贫瘠土壤良好的适应性，苏铁是在整个组织水平生态位之间研究植物和微生物群落之间联系的重要模型。本研究在攀枝花不同样本类型中检测到高度多样化且结构紧密的微生物群落以及生态位特定的微生物群。然而正如先前的研究结果所述，生物地理学在自然和人工栽培栖息地之间的微生物群落分化中并没有发挥作用。此外，本研究提出了攀枝花苏铁微生物群的起源和传播方式。苏铁主要微生物组可能通过供应养分、促进幼苗生长以及提高耐旱性而使宿主受益。总体而言，本研究全面了解了残遗裸子植物不同部位相关的微生物组，为进一步研究干旱和贫瘠土壤环境中植物与微生物的相互作用提供了一定的理论基础。

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