科研 | AEM: 短期施氮影响农业土壤微生物群落组成和氮素矿化功能

编译：大玉儿，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

土壤胞外酶在氮矿化过程中起重要作用。然而，很少有研究记录酶活性和发挥这一功能的微生物群落之间的联系。本研究调查了4年多来无机和有机氮肥对土壤微生物群落及其氮矿化功能的影响。土壤取自青贮玉米田，采用四种对照氮处理:对照（不添加氮）、硫酸铵（AS：100和200公斤氮每公顷），以及堆肥（200公斤氮每公顷）。

利用扩增子测序对整体细菌群落（16S rRNA基因）、细菌尿素水解菌群（ureC）、细菌甲壳素分解菌群（chiA）进行综合评价。采用实时荧光定量PCR和宏基因组学方法检测了氮矿化相关基因。酶（和标记基因）包括蛋白酶（npr和sub）、甲壳质酶（chiA）、脲酶（ureC）和精氨酸酶（rocF）。

堆肥在施用一个季节后，总体细菌群落的多样性显著增加，而铵肥在四个季节对总体细菌群落没有影响。施氮肥显著改变了细菌尿素水解菌群和甲壳素分解菌群。堆肥处理可显著提高土壤酶活性。氮处理对功能基因丰度无显著影响，与酶活性无相关性。氮矿化基因在基因定向组装的基础上从土壤宏基因组中被恢复。了解与氮矿化有关的土壤微生物群落的结构和功能如何因施肥措施而发生变化，可能有助于制定适当的农业管理措施，在改善生态系统服务的同时减少对环境的负面影响。

论文ID

原名：Short-term nitrogen fertilization affects microbial community composition and nitrogen mineralization function in an agricultural soil

译名：短期施氮影响农业土壤微生物群落组成和氮素矿化功能

期刊：Applied and Environmental Microbiology

IF：4.077

发表时间：2019年12月

通信作者：Jeanette M. Norton

通信作者单位：犹他州立大学植物、土壤与气候学系

实验设计

结果

1.土壤氮转化速率和酶活性

2014年8月，氮肥处理对土壤氮素转化速率和酶活性的影响最为显著，但总矿化速率和总氨耗速率无显著差异（表1）。粗硝化、净氮矿化和净硝化在AS处理和堆肥处理中均高于对照，但在AS处理和堆肥处理中无差异。对照处理和堆肥处理的总硝酸盐消耗率高于对照处理。与其他处理相比，堆肥处理的土壤呼吸速率、脱氢酶活性、酸性磷酸酶活性和碱性磷酸酶活性均显著提高。

氮处理和采样时间显示显著影响脲酶、精氨酸酶、蛋白酶和β-氨基葡萄糖苷酶的活性（图1和表S1）。一般来说，这四种酶在堆肥处理土壤中比其他处理有更高的活性（图1）。然而，酶活性随取样时间的变化呈现出不同的模式。脲酶和精氨酸酶活性在7月最低。蛋白酶活性随生长季节的增加而增加，在9月和10月有较高的活性。相比之下，β-氨基葡萄糖苷酶活动在整个季节中是相对恒定的。

图1 2014年4个氮处理的土壤酶活性。误差条表示标准误差(n=4)。柱状图上不同的字母表示在一个月的氮处理之间的显著差异(p<0.05)，基于重复测量方差分析。

2.氮矿化相关基因丰度

氮处理和采样时间对2014年4个与氮矿化相关的功能基因丰度无显著影响（补充图1和补充表2）。sub、npr、chiA和ureC基因的丰度的平均值分别是3.8×10⁷、2.7×10⁵、2.2×10⁸和9.7×10⁷拷贝数每克干土。皮尔森相关分析表明，这些功能基因的丰度与相应的酶活性之间不存在显著的相关性（补充表3）。

2011年8月至2014年8月重复测量ureC丰度。重复测量方差显示年份（p<0.01）显著改变了ureC丰度，而不是氮处理（p=0.43），从2011年的3.2×10⁷每克干土到2014年的1.08×10⁸每克干土（补充图2）。

3.细菌群落组成

2011年和2014年总共32个样本得到1944732高质量16S rRNA序列，17152个OTUs。在所有的土壤样本中，我们检测到45个不同原核门，尽管只有12细菌和1个古菌门是最普遍的（>1%）（补充图3）。Proteobacteria，Actinobacteria，Acidobacteria，Bacteroidetes和 Gemmatimonadetes是5种最丰富的类群，占细菌类群相对丰度的75%以上。双因素方差分析显示Proteobacteria，Actinobacteria 和Acidobacteria的相对丰度随着氮处理显著变化（图2a和补充表4）。Actinobacteria 和Acidobacteria丰度在2011年通过堆肥降低，而Proteobacteria丰度在2014年随着堆肥增加。这些主要的原核的门的丰度受到采样时间的显著影响（补充表4）。例如，Acidobacteria，Bacteroidetes和Verrucomicrobia丰度增加，而Actinobacteria和Fimicutes的丰度降低从2011到2014年。

图2 (a)变形杆菌、酸杆菌和放线菌的相对丰度，经氮处理后发生显著变化。误差条表示标准误差(n=4)。小写字母表示某一年氮处理间差异有统计学意义。(b) 2011年和2014年四种氮处理下细菌群落加权UniFrac距离的NMDS分析。

氮处理显著影响原核群落的α多样性，而不是年份（图3）。堆肥处理的Chao1，检测到的OTUs和香农多样性在2011和2014都增加。细菌群落结构通过加权UniFrac距离显示2011年和2014年不同，并且堆肥处理与AS处理和对照处理在两年中都显著区分开来（图2b）。双因素置换多元方差分析进一步证实细菌群落结构受到年份（p=0.001）和氮处理（p=0.008）的显著影响。

图3 氮处理土壤细菌群落的α多样性。误差条表示标准误差(n=4)。小写字母表示某一年各处理间差异显著(p<0.05)。

基于log2倍变化的OTUs相对丰度，许多OTUs对无机和有机氮肥均有显著的响应（图4）。大多数响应显著的OTUs主要来自Proteobacteria和Bacteroidetes，被氮施肥富集。2011年，只有少数OTUs对无机氮添加有响应，而41个OTUs受堆肥处理显著影响。在2014年，在AS100，AS200和堆肥处理中分别有33，51，78个响应OTUs。AS100和AS200共享一半响应OTUs，而AS和堆肥处理之间共享的响应OTUs少于4%（补充图4a）。在堆肥处理中，只有7个响应OTUs在2011和2014之间共享（补充图4b）。

图4 与对照处理相比，2011年和2014年OTUs相对丰度log2倍的变化。每个圆表示一个调整p值< 0.1的单个OTU。虚线和点线分别表示增加或减少2倍和10倍。

4.尿素水解群落组成

在2014年6月的16个土壤样本中总共得到了875,995条高质量ureC序列，8550个OTUs。根据与参考分类法的最接近的匹配，我们发现了10个不同的原核生物门，虽然只有7个细菌门是最普遍的（>1%）(图5a)。大部分序列为Proteobacteria（72%）和Actinobacteria（12%）。也检测到Thaumarchaeota但是它们的相对丰度很低（0.4%）。在氮处理之间门的相对丰度没有显著差异。氮处理显著改变了加权UniFrac距离矩阵所示的尿素水解菌群组成（p=0.003）(图5b)。成对比较证实堆肥处理与AS100（p=0.026）和AS200（p=0.031）显著不同。

相对丰度前50个ureC OTUs被用来做更详细的系统发育分析（图6），占总序列24%。这里面大多数分类到Proteobacteria下的Burkholderiales，Rhizobiales和Myxococcales科下。OTU 455与根瘤菌亲缘关系密切，不与其他变形杆菌科同组。OTU88和OTU436分别属于Nitrospiraceae和Myxococcales。有趣的是，一些相对丰度比较多的OTUs比如OTU54、OTU100和OTU456没有与参考数据库匹配到最近的。在前50个OTUs中，15个OTUs受到氮处理的显著影响。例如，OTU313和OTU668随着堆肥处理增加。然而，一些OTUs，比如OTU483和OTU233随着AS200显著降低。

图5 (a)细菌ureC优势门的相对丰度(>1%)。(b) 4种氮处理下细菌ureC加权UniFrac距离NMDS分析。(c)细菌chiA的优势门相对丰度(>1%)。(d) 4种氮处理下细菌chiA的加权UniFrac距离的NMDS分析。

图6 前50个最丰富部分ureC OTUs的最大似然树。不同的枝叶颜色表示不同的ureC门(颜色编码见图5a)。热图表示2014年6月4个氮处理间ureC的OTUs相对丰度(平均值，N =4)。星星表示对照处理和AS处理之间的显著差异，而圆圈表示对照处理和堆肥处理之间的显著差异。

5.甲壳素分解群落组成

2014年6月的16个土壤样本中总共获得53709个高质量chiA序列，3572个OTUs。根据与参考分类法的最接近的匹配，大多数OTUs分类到Actinobacteria和Proteobacteria（图5c）。在堆肥处理中，Actinobacteria的相对丰度是最低的，但是Proteobacteria最高的。氮处理显著改变了加权UniFrac距离矩阵显示的甲壳素分解群落组成（p=0.01）（图5d）。两两比较表明，对照处理与AS100（p=0.029）和AS200（p=0.034）处理有显著差异。

采用前50个chiA OTUs进行详细的系统发育分析（图7），占总序列的26%。这些OTUs被分类到Actinobacteria门下的Streptomyces（比如OTU127和OTU265)，Lentzea（比如OTU70和OTU200），Actinoplanes（比如OTU642）科。相对丰度最高的OTU155近似于Xanthomonadaceae。在50个OTUs中，13个OTUs受到氮处理的显著影响。例如，OTU642，OTU52和OTU42随着堆肥处理增加，而OTU155和OTU433随着AS处理显著增加。

图7 前50个最丰富部分chiA OTUs的极大似然树。不同颜色的枝叶代表不同的chiA门:放线菌门(紫色)，变形菌门(绿色)，厚壁菌门(蓝色)，未分类菌门(红色)。热图显示的是2014年6月4个氮处理中chiA的OTUs相对丰度(平均值，N =4)。星星表示对照处理和AS处理之间的显著差异，而圆圈表示对照处理和堆肥处理之间的显著差异。

6.氮矿化基因的基因靶向组装

所选氮矿化基因中的4个（npr、chiA、rocF、ureC）在我们的4个土壤元基因组中以基因靶向组装的方式被恢复（补充表5），而sub基因没有以相同的方法被恢复。这4个被选择的氮矿化基因的OTUs恢复率为95%，范围从4个到280个，它们的rplB在4个土壤元基因组中的丰度为0.01到0.44。与其他氮矿化基因相比，rocF和ureC的OTU数量和丰度较高。并总结了这些氮矿化基因的前10位OTU及其与参考数据库的最佳匹配（补充表6）。靠前的npr和chiA OTU代表与FunGene的参考序列的相似度通常较低，平均为61%。丰度靠前的rocF OTUs主要属于为Acidobacteria和Proteobacteria。有趣的是，大多数丰度靠前的ureC OTUs属于Thaumarchaeota。

7.堆肥中微生物群落组成

对2011年添加到堆肥处理中的牛粪堆肥中的细菌群落组成也与土壤样品一起进行了分析。堆肥中有6个主要的门(>1%) (补充图5a)，Proteobacteria，Bacteroidetes和Actinobacteria是三个最丰富的门。施用堆肥3个月后，在经过堆肥处理的土壤中检测到大约42%的来自牛粪堆肥的OTU。其中来自堆肥中20%的OTU只在堆肥处理后的土壤中检测到，而不是对照土壤，这占了堆肥处理土壤中OTU的6.6%（补充图5b）。这些OTU只在处理过的土壤和处理过的堆肥之间共享，我们发现其中的18个OTU也出现在41个响应的OTU中。

还测定了2013年使用的牛粪堆肥中尿素水解菌和甲壳素分解菌的群落组成。约90%的ureC序列被分配到Proteobacteria（补充图5）。一年后，50%以上的来自堆肥的ureC OTU在经过堆肥处理的土壤中被恢复，6.5%的ureC OTU来自堆肥处理的土壤在堆肥和经过堆肥处理的土壤中都存在。除了未分类的门，大部分的chiA序列在牛粪堆肥中被分配到Actinobacteria。一年后，来自堆肥处理的土壤中chiA OTUs，只有1.5%的存在于堆肥和堆肥处理后的土壤中（补充图6）。

讨论

在本研究中，施用有机氮肥（牛粪堆肥）显著改变了细菌群落结构。这个改变是在施用三个月后检测到的。堆肥强烈地增加了细菌群落的丰富度和多样性。这一观察结果与之前的大多数研究一致。堆肥处理土壤细菌群落多样性的增加，部分是由于高速效养分和不同的有机碳组分刺激了土壤细菌的生长。此外，研究人员发现，超过一半的OTU来自于经过堆肥处理的土壤，在施用三个月后被恢复。土壤中直接引入外源物种可能有助于增加微生物多样性，尽管从长期来看，来自堆肥的微生物与本地土壤微生物群落的竞争力可能会降低。虽然已有研究表明，矿质氮肥降低了农业土壤细菌群落的多样性，但我们的研究结果表明，矿质氮肥对整体细菌群落的多样性和结构没有影响。这种稳定性可能与农业经营历史有关。在2011年之前的10年里，本研究的田地里反复种植小麦，并吸收尿素作为氮源。这种作物单一栽培和重复尿素施肥可能使微生物群落均质化，有利于那些因施用无机氮肥而对变化有抗性的微生物群落。

研究人员发现，2011年至2014年间，整体细菌群落发生了显著变化。土壤微生物群落具有很强的季节性和年际变化性。Duncan等报道了两年间玉米田间细菌群落的显著变化。Lauber等研究发现，农业土壤的群落组成随时间而变化，群落的变化与土壤湿度和温度呈正相关。更有趣的是，发现响应性OTU的数量从2011年到2014年显著增加。这些响应性的OTU大部分来自Proteobacteria和Bacteroides，它们通常被认为是共生菌。此外，在2011年至2014年期间，共享OTU的份额非常小。这些结果表明，在施肥后的短期内，细菌群落的时间变异性非常高。

氮处理显著改变了土壤中尿素水解菌的群落组成。更具体地说，无机氮和有机氮处理具有明显的尿素水解群落组成。其他关于农业土壤的研究表明，来自堆肥或粪肥的有机质可能影响土壤尿素水解微生物群落。还观察到，在2014年，AS和堆肥处理之间的土壤有机碳有显著差异。在该研究中，超过50%的来自堆肥的OTU在施用三个月后仍然存在于经过堆肥处理的土壤中。这些栖息在堆肥中的微生物也可能在堆肥处理土壤中形成尿素水解群落组成方面发挥重要作用。研究人员还发现，在前50名的OTU中，有15个被氮处理显著改变。有趣的是，其中5个受影响的OTU因施用堆肥而得到了丰富，而大部分受影响的OTU因施用堆肥而减少。这些结果表明，氨基肥料对某些尿素水解微生物有抑制作用。

在本研究中，扩增子测序表明尿素水解菌群落主要属于Proteobacteria。这与Collier等人的研究一致，他们总结出细菌脲酶最常见于变形杆菌。值得注意的是，许多ureC OTU，甚至一些相对丰富较高的OTU，都没有与当前参考数据库相匹配的鉴定（>85%可信度）。这表明，以引物为基础的扩增子测序提供了一些关于先前未培养的尿素水解微生物的信息。有趣的是，以基因为目标的土壤宏基因组组装显示，这些恢复的靠前的OTUs中有许多与Thaumarchaeota相关。虽然相对丰度很低，但确实通过扩增子测序发现了与Thaumarchaeota亲缘关系密切的ureC序列。之前的研究发现，在本研究的土壤中，通常含有ureC的AOA含量丰富。ureC的宏基因组和扩增子测序之间的差异提示存在潜在的引物偏倚。然而，扩增子测序和宏基因组分析都证实了Nitrospira是重要的潜在的脲酶产生者，因为有几个靠前的ureC OTUs来自Nitrospira，其中一些甚至与comammox有机体N.inopinata非常接近。

甲壳素是土壤环境中含量最丰富的有机氮聚合物之一。以往的研究发现，甲壳素修饰显著改变了甲壳素分解菌群。由于堆肥含有多种有机氮聚合物，研究人员假设堆肥的施用也会塑造甲壳素分解群落。确实观察到堆肥处理显著增加了几个靠前的chiA OTUs（图7）。但是，在连续施用堆肥4年后，对照和堆肥处理的甲壳素分解菌群没有显著差异。这部分是由于在堆肥处理中甲壳素分解群落组成的高变异性。堆肥处理中的3个重复与对照处理的重复高度分离，但其中一个堆肥处理的重复与对照处理的重复紧密聚集在一起。此外，发现堆肥中只有1.5%的chiA OTUs在堆肥处理后的土壤中被恢复，这表明堆肥中甲壳素分解微生物的竞争力低于本地甲壳素分解菌群落，并且在土壤中的生存能力较弱。有趣的是，AS处理显著改变甲壳素分解群落。一些靠前的chiA OTUs被氨基肥料富集（OTU 155和OTU 433）。这些结果表明，土壤中甲壳素分解群落可能是氮限制的。

在本研究中，堆肥的施用增加了土壤酶活性，这与有机改良剂显著增加酶活性的观察结果一致。这可能是由于刺激微生物生长和相关的细胞外酶-有机配合物活性的增加。然而，研究人员发现，氮处理并不影响氮矿化相关功能基因的丰度，而且氮矿化相关功能基因的丰度与相应的土壤酶活性不相关。功能基因的丰度与相应的酶活性之间缺乏相关性可能是多种因素造成的。首先，用于定位功能基因的引物并没有覆盖所有负责特定酶功能的微生物群落。例如，蛋白酶有许多不同的组，但只有有限的蛋白水解基因引物已被开发和识别的土壤微生物组，包括丝氨酸肽酶（sub）和中性金属肽酶（npr）。此外，在本研究中使用的引物对没有覆盖真菌群落。原核和真菌群落的宏基因组分析可能为产生特定酶的功能组提供更好的覆盖，尽管测序的深度仍然是一个问题。第二，基于DNA的分析不能区分土壤群落中活跃的成员和不活跃的成员。以蛋白质组学或RNA为基础的技术可能更适合将活性官能团的丰度与其相应的酶功能联系起来。第三，细胞外酶的产生受编码相应酶的基因的调控，但一旦它们被分泌出细胞外，它们的稳定和降解就受到环境的物理和化学条件的控制。Fuka等报道，sub和npr基因与潜在蛋白酶的显著相关关系仅在砂土中发现，而在粘土中没有发现，这表明这些关系可能是土壤特异性的。

综上所述，施用有机氮肥，而不是无机氮肥，增加了细菌群落的多样性和土壤酶活性。氮施肥显著改变尿素水解和甲壳素分解细菌群落。无论施用无机肥还是有机肥，都不影响氮素矿化过程中所选功能基因的丰度。目的功能基因的丰度与酶活性无关。与高通量测序相关的宏基因组学或宏转录组学需要包括来自真菌的功能基因在内的功能基因，以便为微生物群落中起作用的新成员提供更好的覆盖。有了这些信息，就能加强将微生物功能基因与其相关酶活性联系起来的能力。

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