编译：茗溪，编辑：小菌菌、江舜尧。
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出生后，新生儿肠道暴露于母体细菌和环境细菌中，相继形成密集且高度动态的肠道菌群。虽然外源性因素的影响已被广泛研究，但内源性和宿主介导的机制还鲜有学者进行深入探索。伴随着微生物定殖，肝脏经历了从造血器官到代谢调节和免疫监测的中枢器官的功能转变。
本研究旨在分析肝功能和肝脏代谢对早期肠道菌群的影响，通过结合代谢组学、微生物分析和多变量分析方法报告了定殖动力学和肝脏代谢在小鼠胃肠道（每个年龄组n=6-10）的特性。本研究观察到主要的年龄依赖性微生物和代谢变化，并确定胆汁酸（Bile acids）是早期肠道菌群成熟的强有力的驱动因素。此外，新生小鼠（每组的7-14天龄）口服牛磺胆酸（TCA，tauro-cholic acid）或盐酸牛磺胆酸（βTMCA，β-tauro-murocholic acid）均可加速出生后微生物群的成熟。
论文ID
原名：Bile acids drive the newborn’s gut microbiota maturation
译名：胆汁酸促进新生儿肠道菌群的成熟
期刊：Nature Communications
IF：12.121
发表时间：2020.07
通讯作者：J. Penders & M. W. Hornef
作者单位：德国亚琛工业大学医学微生物研究所&德国亚琛工业大学附属医院
实验设计
为了描述肠道微生物群的成熟过程，首先分析了同一窝出生的动物在刚出生、婴儿早期和断奶至成年期间小肠和大肠的微生物组成。随后，对同一动物的肝脏组织进行了全面的代谢筛选，以提供位点特异性代谢产物的信息。多组学分析鉴定了与早期肠道菌群成熟相关的特异性胆汁酸，之后的介入研究从功能上证实并明确了特异性胆汁酸作为菌群发育的重要驱动因子的作用。
1．伦理道德声明：所有动物实验均按照德国动物保护法（TierSchG），并得到了当地动物福利委员会的批准。所有的C57BL6J野生型小鼠均为亚琛工业大学附属医院的实验动物科学研究所在当地培育并在特定的无病原体条件下饲养的。出生的日子被认为是第0天，第1天接受筛查的动物年龄约为24 h且有母乳摄入，小鼠在第21天断奶。
2．体内实验设计：为了监测从新生到成年期间的微生物群和宿主代谢发育，采用两种不同的方法从C57BL/6J小鼠中获取肠和肝组织。第一组，从1、7、14、21、28和56天（每个时间点n=5）的C57BL/6小鼠中获取总小肠、结肠和肝脏组织。在另一组实验中，从0、6、12、18和24 h（每个时间点n=10）的小鼠身上获得了类似的组织。为了排除潜在的窝舍和笼舍效应，对给定年龄组的一窝动物进行了组织提取，并从同一窝舍中为每一个其他年龄组选择一只新动物进行重复提取（图1a）。每只动物在指定年龄只接受一次检查。总之，共使用5窝的30只动物监测1-56天龄期的微生物群发育情况，使用10窝的46只动物监测24 h内的微生物群发育情况。让7-14天龄期的动物口服胆汁酸（UDCA和对照组，n=14；GCA组，n=11；TCA组，n=10；βTMCA，n=7）。其中，7天龄期动物连续3天口服特异胆汁酸，浓度为70 mol/g/g体重或PBS（平均5 μL）。每天监测体重和食物/水的消耗量。为了确定胆汁酸给药的效果，小肠被无菌切成10-20个部分，轮流分配到两组样本中进行微生物分析和代谢物评估。另一组成年期的样本8-12周龄动物（n=5）平行处理，以提供成年菌群控制。将上述组织转移到无菌的微型离心管中，收集到的7、14、21和56天大无菌小鼠的肝脏组织保存在无菌试管中，保存在-80℃，直到进一步分析。
3．DNA分离和序列数据的生成：采用RBB结合化学裂解和柱状纯化的方法从冷冻小肠和结肠组织中提取总宏基因组DNA。之后从每个DNA样本中PCR扩增16S rRNA基因的V4区，经过纯化和定量操作后完成扩增子测序。最后，将本研究中生成的所有V4 16SrDNA细菌序列提交至Qiita和ENA数据库。
4．序列分析：主要使用在线集成微生物下一代测序（IMNGS，www.imngs.org）平台、USEARCH 8.0、UCHIME、MUSCLE、Fasttree、RDP classififier2.11等软件完成序列分析，其中IMNGS是一个基于UPARSE的分析管道。在两次运行中总共生成了21,372,397个V4 Reads。经过修剪、质量过滤、去除潜在的嵌合读出、解多路复用和去除低丰量操作分类单元（OTUs），共保留478个OTUs序列15,692,587个Reads用于下游分析。之后对每个批次使用了采样空白对照、DNA空白提取对照和无模板扩增对照，并根据凝胶原理监测此处污染细菌DNA载量的缺乏情况。此外，本研究将从阴性对照中获得的OTUs成分与低丰度微生物样本进行比较，以确保本研究的结果不是由潜在的污染类群驱动的。后续的分析中排除了阴性对照和低测序深度的样本（少于6749个序列/样本）。对于剩余的样本，每个样本的序列数从6749到239,395（中位数87,227）不等。
5．丰富度、多样性、分类学和肠型分析：使用Rhea 1.6进行数据标准化、多样性、分配和组比较。为了不丢弃有用的数据，Rhea标准化步骤中通过将每个样本的OTU计数除以其总计数（样本深度），然后乘以最低样本深度（6749个读数/样本）的所有相对丰度。Alpha多样性指数和Beta多样性指数使用Rhea和R package 3.6.1进行计算。最后使用主坐标（PCoA）和主成分（PCA）分析完成样品的微生物丰度和组成排序可视化。
6．下游微生物分析和展示：利用ggplot包3.2.1的geom_smooth函数对优势类群（图1e和f，以及补充图1d和e）的动力学进行修剪处理。生态系统特定功能宏基因组预测是由新的PICRUSt-iMGMC流程（使用PICRUSt 1.1.3版本）、重新选择的OTUs、结合小鼠宏基因组组装的基因组和16SrRNA基因等共同创建的。导出的KEGG同源序列被映射到多个通路或模块中。使用MicrobiomeAnalyst在默认设置下的通路富集分析来识别差异变化的KEGG模块。利用EZbiocloud对乳酸菌相关OTUs进行鉴定并通过MEGA7（MUSCLE）构建乳酸杆菌系统发育树，最后的标注由iTOL v4在默认设置下完成（itol.embl.de）。
7．肝脏代谢组学和胆汁酸分析：代谢组分析使用AbsoluteIDQ®p180试剂盒进行。对照组包括3个不同浓度水平，为了校准，试剂盒包含了7种不同浓度的校准器混合物。测量采用ABISciex API5500 Q-TRAP质谱仪，通过多反应监测（MRM）模式电喷雾电离（ESI）进行，具有很高的特异性和灵敏度。158对MRM在正离子模式下测量（13 IS），2对MRM在负离子模式下测量（1 IS）。每个代谢物对代谢组学变异的贡献均来自年龄限制的冗余分析（RDA），该分析基于组水平中所有分层的代谢物，并通过Phyloseq软件包的标准化进行了额外缩放。此外，PCA用于阐明产后期间（PC1和PC2，PC2和PC3）不同代谢组的组成变化。对于胆汁酸，选择第2和第3组分进行绘制，因为第1组分主要是由第1和后续时间点分离较强所驱动的（PND1：PND7-56）。
8．多组学分析：为了阐明胆汁酸和OTUs之间的特定相关性，使用了所有样本中最小的浓度值20%进行正则化典型相关分析（rCCA；Mixomics package6.10.8）。微生物数据排除了胆汁酸分析中没有测量出的第1，2窝动物中第1天龄的样本。在rCCA之前，对OTU计数使用双曲正弦变换，对胆汁酸进行对数变换。为了估计正则化参数λ1和λ2，使用了交叉验证程序（CV）方法。多项测试的校正使用Benjamini和Hochberg FDR校正（p>0.05）。热图仅显示调整后的p值<0.05的显著相关性，并根据其PCA加载评分进行排序。
9．肝脏基因表达分析：从肝脏组织中提取总RNA，紫外吸收测定RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。将750 ng总RNA转化为单链cDNA，输入Sybr Greenchemistry和LightCycler®480系统完成实时PCR分析，输入的cDNA相当于16 ng总RNA。使用PrimerBlast来设计引物对，通过琼脂糖凝胶电泳验证正确的扩增子大小。real-timeqPCR数据采用LinRegPCR分析。基因表达数据归一化到两个参照系的几何平均值。
10．16SrDNA基因qPCR的绝对丰度：确定16S rDNA基因拷贝数，以量化样本中细菌基因组的数量，并将相对OTU丰度转化为细菌绝对数量。在已知编码目标16S基因序列的质粒浓度的情况下，将CT值与标准曲线比较，计算出16S基因的总拷贝数。通过将每个样本的相对丰度与16SrDNA基因拷贝数相乘计算绝对OTU数。
11．体外培养测定：选取3种乳酸杆菌和先前从小鼠肠道分离的1种大肠杆菌完成体外生长测定。乳酸杆菌和大肠杆菌菌株分别在MRS和BHI培养基中过夜培养。将培养物以1：100稀释，并在不存在或存在1％（w/v）UDCA，TCA，GCA或βTMCA的96孔板中以厌氧条件下于37℃孵育24 h。细菌生长通过在570 nm（OD570）处的光密度（OD）测量来确定，并表示为在含1％胆汁酸的培养基中的OD570/在不添加胆汁酸的培养基中的OD570。
结果
为了研究出生后肠道微生物的发育，获得了从0、6、12、18和24 h（n=10/年龄组）以及出生后1、7、14、28，56天（n=6/年龄组）小鼠完整的小肠和结肠组织，涵盖早期发育阶段直至成年。为避免产仔影响，在动力学中给定的所有时间点的组织都是从一窝产仔动物中连续获取的（图1a）。这些样品的16S rRNA V4基因区域的扩增子测序总共产生15,692,587个高质量序列。随后基于de novo组装将所有序列归类为478个OTU，这些分类单位在分类上被分类为属水平。
在前24 h内，总体群落结构未见实质性变化（图1b）。出生后24 h的小肠和结肠（图1c，d；图2a）的细菌丰富度和多样性均显著降低。随着多样性的减少，小肠和结肠中几乎所有属的相对丰度都在这一时间段内下降。只有棒状杆菌属和曼氏杆菌属的丰度是暂时增加的，它们的峰值分别在6-18 h和24 h（图1e，f）。最初丰富度的减少最有可能表明，在出生期间和出生后不久，摄入的细菌种类短暂地通过肠道它们不能永久地在内繁殖（如棒状杆菌）。因此，发育阶段从24 h开始显示多样化（图1b-f），由此可以判断24 h后的时间点为所有后续分析的重点。
从第7天开始，小肠和结肠的微生物丰富度均增加（图1b，c）。出生时，两个器官的细菌丰富度相似（PND1），但断奶后结肠的细菌丰富度明显更高（PND28，FDRadjustedp=1.7×10−5，Mann-WhitneyU test）。利用Shannon指数也观察到了类似的微生物多样性结果（图2b）。在Sankey图中显示了所有出生后时间点的小肠和结肠组织中OTUs的存在、起源和丢失情况，以及母系来源情况（图3a，b）。这一分析说明了在出生后不同时间点，所有4个主要门的OTUs对微生物生态系统的贡献。值得注意的是，大部分的变形菌门主要来源于环境而非母体（78.2%的结肠和73.2%的小肠OTUs），能在出生后早期促进了PND1动物微生物群的形成。相比之下，放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门的大部分OTUs在整个检查时期持续存在且与母体共享（结肠和小肠分别为53.3-94.2%和45.0-86.5%）。早期（PND1）变形菌门的贡献在结肠中最为明显，而小肠受变形菌门和放线菌门影响最大。
PCoA图可按年龄明确分离小肠和结肠的微生物组成（图1d）。小肠和结肠的微生物群落结构在早期并无显著差异（PND1-21），但断奶后结构明显分化，形成位点特异性肠道微生物群落。这一结果得到了DMM模型的支持，在该模型中，来自PND1和PND7的小肠和结肠样本聚集在一起，而从PND21开始小肠和结肠微生物群主要由两种不同的簇组成（图2c）。这种分类学上的变化证实了后期会出现一种特异器官的微生物群。其中曼氏杆菌属，链球菌属，埃希菌属，葡萄球菌属是丰度最高的属，小肠和结肠中的肠球菌在产后时期逐渐减少，乳酸菌相对丰度较高（图1e，f）。断奶后，小肠内乳酸菌数量继续相对增加，但随着拟杆菌属、卟啉单胞菌科和链球菌科的增加，结肠中形成了更复杂的成分。
图1 出生后肠道菌群组成动态。（a）研究纲要图：对每一窝的每只小鼠的每一个单独时间点（PND）进行分析。小肠（b）和结肠（c）菌群的丰富度（观察到的物种）随着年龄的增长而逐渐增加（对于所有PND后续分析，n=5，平均值和SD的线性回归分别为R2=0.7702和p<0.0001，R2=0.7281和p<0.0001）。（d）基于Bray-Curtis差异的主坐标分析（PCoA）表明，在新生儿期PND1-PND14期间，微生物群落结构沿着PC2移动；在PND21-56期间，小肠和结肠在PC2方向体现不同的结构（p<0.001，Permanova用于年龄，p<0.01，Permanova用于组织）；正方形和实线：结肠（C）；三角形和虚线：小肠（SI）。e，f表示在PND1-56中，小肠（e）和结肠（f）的相对丰度，其中10个最丰富属的相对丰度在f中列出。
2. 对微生物群有潜在影响的代谢因子
产后时期，肠道的酶和吸收能力以及肝脏的代谢能力显著成熟。与之相关的变化有助于提高管腔底物的利用率，可能对细菌的演替和组成造成影响。为了对上述长期微生物群分析使用的同一组小鼠进行分析，研究了一组肝脏代谢物作为小肠代谢物的替代物，发现主要的与年龄相关的差异在PND7和PND21、28和56之间（图2a-d）。氨基酸，生物胺，酰基肉碱和一些甘油磷脂在这些时间点之间显示出适度但明显的下降，这很可能是由于断奶期间饮食的改变（图2b-d），通常在PND21日后完成。相反，断奶后胆汁酸的数量显著增加，尤其是在PND7和PND28以及PND7和PND56相比时（图2c，d）。使用冗余分析（RDA）在年龄组水平上限制所有代谢物的排序，表明酰基肉碱，氨基酸，甘油磷脂和鞘脂的变化的主要原因是PND1与其他各年龄组有显著差异（补充图4a-c，图5）。相反，肠肝胆汁酸解释了主要的年龄依赖性代谢变化，如RDA2和RDA3所描述的。这些依赖于年龄的代谢变化通过对所有代谢组分别进行无约束排序进一步说明了成分的变化。
3. 胆汁酸的合成、修饰和再吸收的出生后成熟
同样，根据PCA结果，第2和第3个成分的胆汁酸成分随年龄的变化有明显的分离，出生和成年的胆汁酸成分差异较大（图2e）。肝组织中参与胆汁酸合成的基因的转录改变与整体成分变化有关。参与典型胆汁酸合成途径和形成胆酸和鹅脱氧胆酸的关键酶如Cyp7a1和Cyp27a1的转录量早期增加（PND7-14），随后Cyp8b1 mRNA的表达量增加（图2f）。此外，导致鹅脱氧胆酸形成替代途径的关键酶Cyp7b1直到PND28才表达，在这段时间内不太可能对胆汁酸的合成有显著的促进作用。相比之下，Cyp2c70mRNA的早期升高最可能导致小鼠鹅胆酸向多酚酸以及主要胆汁酸种类的转化增加（图2g）。值得注意的是，经典胆汁酸合成途径的关键酶Cyp7a1也在无菌动物中被观察到。无细菌的动物在没有活菌的情况下进行繁殖和饲养，因此这种出生后成熟的现象与微生物无太大关联（图2h）。
在微生物群组成改变的主要时间点可观察到胆汁酸浓度随年龄的变化。肝组织的代谢组分析反映了小肠的情况，因此原代胆汁酸的含量主要由出生后的所有变化来体现。然而，通过群落的系统发育调查（用新型集成的小鼠肠道元基因组目录进行PICRUSt重组）来预测发展中的微生物群的代谢能力，发现与婴儿期相比，成年期（PND56）中编码胆汁酸代谢相关基因的细菌出现了年龄依赖性富集现象。更具体地说，随着年龄的增长，参与细菌胆汁酸代谢的关键酶—胆盐水解酶（BSH，KO1442）的预测丰度稳步增加，大约在PND 21-28岁时达到小肠最高水平（图3a）。值得注意的是，在大肠中观察到含有含有BSH的细菌类群活性高得多。此外，发现参与胆汁酸肝胆运输的蛋白编码基因（例如Ntcp（Slc10A1），Abcb11和Abcb4）的表达稳定增加。通过RT-PCR观察从出生后到PND 56这段时间，发现在全肝组织中存在Fxr-Fgf15-Fgfr4负反馈环中参与调控肝胆汁酸从头合成的蛋白质。与BSH活性增强和肝胆运输系统成熟相一致的是，细菌修饰的二级胆汁酸的肝脏浓度随着年龄的增长而增加，而初级胆汁酸的浓度则下降（图3b）。因此，宿主的胆汁酸生物合成能力和肝胆运输系统成熟，加上细菌胆汁酸代谢增强，导致断奶后总胆汁酸库及其组成发生显著变化。然而，在刚出生的婴儿时期，小肠主要以存在共轭的初级胆汁酸为特征。
4. 代谢组和微生物组数据的综合分析
为了研究胆汁酸暴露对小肠微生物群组成的潜在影响，使用正则规范化相关分析（rCCA）表征了胆汁酸与微生物OTU之间的关系。前两个组成部分解释了具有方差>0.3样本的典范相关性（OTU中27.1％的变化和胆汁酸中54.1％的变化）。UDCA和GCA在第一和第二组分上分别获得最高的典型系数（图3c，d），TMCA和TCA表现出最强的负系数。同样，UDCA和GCA与早期定殖菌（如曼氏杆菌和链球菌）呈负相关，而与能够代谢胆汁酸的细菌（如肠杆菌和乳杆菌）呈正相关（图3e）。相比之下，TMCA显示相反的作用，与红蝽菌科呈负相关，与曼氏杆菌属和链球菌呈正相关。值得注意的是，这些模式与观察到的断奶前和断奶后、出生早期和断奶后特定胆汁酸浓度的变化一致。UDCA和GCA的摩尔浓度在成年期呈上升趋势，TMCA和TCA的浓度则随着时间的推移而降低。结肠胆汁酸和微生物OTU的rCCA分析显示，TCA，MTCA和UDCA对结肠微生物群组成具有相似的高规范系数和显性影响。这可能是因为产后时期含有高浓度的共轭胆汁酸，或者是在此时间范围内小肠菌群对结肠菌群的强烈影响（图3b）。因此，UDCA，GCA，TMCA和TCA与微生物群的组成随年龄的变化显著相关，并且代表宿主源性因素的良好候选者，这些因素可推动出生后肠道微生物群的建立。
5. 胆汁盐介导新生儿肠道菌群的成熟
接下来，让新生小鼠口服4种胆汁酸UDCA，GCA，βTMCA和TCA，并评估了它们对发育中的小肠微生物群的影响。新生小鼠在PND7-PND9之间连续3天接受指定的胆汁酸或PBS作为对照。在PND9，确定了特定部位的小肠微生物群组成。PCoA图揭示，TCA和βTMCA都使整体微生物群组成朝着成年期相似的微生物群组成转变（图4a-b）。同样，根据Bray-Curtis差异分析（图4d），TCA和βTMCA的施用显著增加了小肠菌群的丰富度（图4c），并降低了与成年微生物群组成的距离。相比之下，GCA和UDCA对细菌丰富度（图4c）、菌群成熟度和成年期菌群的相似性均无影响（图4d）。胆汁酸诱导的小肠菌群组成向更成熟的表型转变，进一步得到了小肠中两个最丰富的属—乳酸菌和大肠杆菌的相对丰度的支持（图4e，f）。胆汁酸诱导的小肠微生物群组成向更成熟的表型的转变进一步得到了小肠中的两个最丰富属，乳杆菌和大肠埃希氏菌的相对丰度的支持（图4e，f）。接种βTMCA和UDCA可以增强乳酸杆菌的丰度，而βTMCA则可以显著降低大肠杆菌的丰度。使用乳杆菌/大肠杆菌的比例作为微生物群成熟度的替代指标，βTMCA的施用可使比值达到最高，已十分接近成年期的比值（图4g）。有趣的是，乳杆菌属的OTU对单个胆汁酸的反应不同。
虽然说βTMCA增强了成年期中大量存在的OTU（图5a-c），而UDCA仅影响OTU，对成年期微生物群的贡献很小（图5d，e）。此外，将这些OTU与它们密切相关的乳杆菌一起注释到系统发育树中，清楚地表明了“UDCA-响应者”和“βTMCA-响应者”之间的遗传区别（分为两个独立的关键分支）（图5f）。将绝对细菌数量中的OTU丰度进行转化，证实了在成年菌群中，βTMCA增加了乳酸杆菌OTU的定殖密度，并降低了大肠杆菌的定殖。虽然UDCA也降低了大肠杆菌的绝对丰度，但它增加了成年期微生物菌群中通常未发现的乳杆菌OTU的定殖密度。这一发现可以解释为什么UDCA不能增强新生儿和成年期微生物组成的相似性（图4d）。值得注意的是，通过体外分析探索了UDCA，GCA，βTMCA和TCA对鼠乳杆菌分离株的影响，结果显示，βTMCA对“βTMCA-响应者”（BA_OTU 4，BA_OTU 7和364）有直接的促进作用，但对“UDCA-响应者”（BA_OTU 796和BA_OTU 2）没有，这与体内实验结果一致。UDCA在体外和体内均对鼠大肠杆菌分离物产生抑制作用。与之相反，UDCA对乳杆菌分离物的抑制作用在体外而不是在体内观察到。
讨论
在小肠和结肠中，细菌的多样性和丰富度增加只是在断奶后才开始，并一直持续到断奶后。本研究为了揭示代谢物的位点特异性光谱而分析了相同动物的肝脏代谢物。由于代谢组和肠道菌群的复杂性和个体间差异，使用rCCA进行综合分析。该分析确定胆汁酸是微生物群组成的潜在驱动因素，随着造血组织向中央代谢器官的转变，人类肝脏的胆汁酸生物合成能力增加。与先前的观点一致，代谢组学和转录分析发现人的新生儿肝脏能够在小肠中产生并分泌大量的胆汁酸，其中产后立即共轭的胆汁酸占主导地位，断奶后也在小肠中以高浓度存在。它们可能会对小肠产生重要影响，其中已证明微生物群组成对新生儿粘膜免疫系统成熟有关键影响。微生物群组成的连续成熟随后引发了细菌介导的胆汁酸修饰，断奶期间胆汁盐水解（BSH）编码基因的增加说明了这一点。
胆汁酸的两亲性破坏了细菌细胞壁的完整性，从而发挥了潜在的直接抗菌作用，这与我们对UDCA的研究结果一致。在体内，它们还可能与其他抗菌分子产生协同作用，这些抗菌肽也针对细菌表面。根据本研究结果，虽然存在一些普遍的系统发育差异，但在胆汁酸耐受性方面有很大的物种特异性差异。另，小鼠和人体内的特异性胆汁酸可调节可溶性介质的分泌，影响粘膜免疫系统和宿主整体代谢，而诱导的变化可能反过来间接影响出生后肠道菌群。此外，所述活性可能会对细菌类群产生不同的影响，因此，胆汁酸可能通过多种机制影响肠道菌群的组成。
口服两种主要的结合胆汁酸，βTMCA和TCA证实了它们的功能活性。牛磺酸结合的胆汁酸增强了新生儿小肠菌群的丰富度，使其更接近于成人的组成。βTMCA和TCA可以抑制新生儿微生物群的细菌并促进成年期微生物群生长。同时，βTMCA降低了大肠杆菌的丰度而增加了乳酸杆菌的丰度，从而转化了乳酸菌：大肠杆菌的比例。值得注意的是，胆汁酸的施用影响乳杆菌属的方式并不相同。根据现有数据库（包含BSHs），体内βTMCA给药增强了乳杆菌OTU的丰度并且与占主导地位的小鼠乳杆菌菌种（包括BA_OTU 7，BA_OTU 364和BA_OTU 4）密切相关。相反，与不包含BSHs的物种有关的OTU仍然不受影响。BSH具有不同的催化效率和底物偏好。大多数约氏乳杆菌菌株携带多个BSH，这可能解释了为什么TCA还能在体内增强BA_OTU 4的丰度，而不会影响与罗氏乳杆菌相关的OTU。实际上，来自约氏乳杆菌的BSH在底物特异性上显著不同。
值得注意的是，给予的胆汁酸不仅可以直接发挥作用，还可以通过细菌对CA或DCA的修饰，或者通过诱导宿主代谢变化来发挥作用。与βTMCA和TCA相反，UDCA和GCA对微生物群的成熟和丰度没有影响。UDCA具有高度溶解性，通常被认为是无毒的胆汁酸，对宿主的胆汁酸受体几乎没有活性。GCA是甘氨酸结合胆汁酸的代表，在人类中很常见，但在小鼠中罕见。因此，小鼠宿主微生物群中底物的特异性和甘氨酸的低结合酶解能力低可能解释了GCA缺乏对微生物群丰度和成熟度的显著影响。然而，在多组学rCCA分析中观察到的微生物和胆汁酸种类之间的关联，与口服胆汁酸引起的微生物变化并不完全匹配。这些差异可能反映了胆汁酸暴露的时间进程、昼夜节律和剂量。此外，给药胆汁酸的代谢转化，如GCA和TCA的去解毒或转化为CA和DCA，也可能对此有贡献。尽管研究表明，人类新生儿比成年人类更能产生牛磺酸主导的胆汁酸偶联（类似于在小鼠中观察到的情况），但小鼠和人类的优势胆汁酸种类存在差异，本研究的发现可能不能完全反映人类的情况。但是，出于伦理考虑，无法使用人类健康的新生儿肝脏和小肠组织样本。同样，人类粪便细菌组成也不能反映小肠微生物群。未来的研究需要找到分析人类新生儿肝脏和小肠组织样本的方法，并将分析范围扩大到稀有的胆汁酸种类。此外，需要进一步了解胆汁酸通过其影响肠道各个解剖部位微生物群落成熟的潜在机制。
深入了解在生命早期影响微生物组形成的生态因素尤为重要。这些因素在出生后的非冗余时间点中起作用，对宿主的免疫系统至关重要，对炎症和免疫介导疾病的易感性产生终生影响。从生态学理论的角度来看，胆汁酸浓度和物种分布可能促进诸如环境过滤或基于小生境的相互作用等过程。胆汁酸在多大程度上影响了人体内微生物群组成的个体间差异，这应该是未来研究的重点。
本研究的局限性是缺乏宏基因组学数据以及在肝组织中分析的代谢产物数量有限。宏基因组信息将提供对鉴定出的分类单元功能特征的更多见解，并允许菌株水平与检测到的代谢物相关。同样，对一组更广泛的代谢物或非靶向代谢方法的测量可以揭示在出生后早期微生物组发展中起重要作用的其他化合物类别。此外，对结肠微生物群和胆汁酸代谢的分析可能会提供进一步的见解。出生后微生物组发育的其他因素可能通过将来对粪便和血液等其他样品中代谢物的分析来确定。
总之，本研究确定胆汁酸是塑造产后肠道微生物群组成的宿主因素。因此，出生后肝脏从造血组织过渡到代谢调节的中央器官可能会大大促进产后体内宿主-微生物稳态的建立。本研究结果可能有助于确定策略，以补偿必要的医学干预措施（如早期抗生素治疗）的不利影响，并促进与有益宿主微生物体内稳态相一致的微生物组成。
评论
人类肠道菌群组成的紊乱与高度流行的代谢和免疫介导的疾病有关。因此，详细了解在健康宿主中建立和维持有益菌群组成的机制是非常重要的，特别是这与刚出生和婴儿早期相关。值得注意的是，出生后早期的定殖过程对长期的微生物群组成和免疫成熟至关重要，因此对高度流行的非传染性疾病的易感性也至关重要。近年来，人们对出生后肠道细菌定殖的过程进行了深入研究，已鉴定出显著影响早期微生物群组成的外源因素。然而，外源因素只能解释微生物群组成中个体间变异的有限数量。很少有研究试图描述宿主介导的内源性机制，例如，遗传因素塑造了出生后早期的微生物生态系统这种内源性机制的鉴定和表征有望为微生物群特定方面的功能相关性提供见解，因为它们是宿主-微生物长期共同进化的结果。
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