编译：王一，编辑：谢衣、江舜尧。
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背景：随着全球人口与人均粮食消耗量激增，人们对粮食和蔬菜的需求也与日俱增。在此背景下，PGVC因能供应大量优质的淡季新鲜蔬菜应运而生。在PGVC体系中，植物根际微生物群落是土壤有机质转化的关键驱动因素，对于辣椒的健康成长至关重要。同时，DOC（含根系分泌物）作为土壤微生物碳源，在土壤根际区域形成的根部-微生物互作中发挥重要作用。因此，增强对这一互作关系的理解，能将其更好的应用于提升蔬菜质量产量。
方法优势与创新：为阐明这种互作关系，研究人员首先通过高通量测序获得根际和非根际土壤的微生物群落结构，但土壤宏基因组技术在对土壤微生物代谢功能方面的解析望尘莫及。而土壤代谢组学是最新兴起的一项技术，能直接反应不同条件下土壤微生物可检测到的生化响应。使用土壤代谢组学来区分根际土和非根际土之间的微生物群落功能差异是可行的，这将有助于理解PGVC蔬菜的重要根际过程。基于文献调研，在PGVC体系下仍缺乏根际土壤代谢组和细菌群落的联合研究。
结果：研究人员旨在揭示PGVC体系下辣椒根际和非根际土壤的土壤代谢物差异，并通过土壤代谢组学建立其根际化学和细菌群落的关系，首次将土壤代谢物和细菌群落结构进行了关联研究。结果发现：1. 根际土和非根际土的总DOC含量并无显著差异；2. 根际土和非根际土之间检测到11种差异代谢物，包括有机酸和糖，与差异细菌的相对丰度呈正相关或负相关。3. 通路富集分析表明，根际土和非根际土之间淀粉和蔗糖代谢通路的差异最大，且参与该途径的主要功能基因在根际土中下调。该研究为理解土壤中植物微生物互作提供了新的见解。此外，研究人员还关注了塑料薄膜应用下的土壤PAEs污染问题，发现检测到的种类主要是DEHP、DiBP、DnBP，且根际和非根际土壤主要PAEs种类含量无显著差异。
论文ID
原名：Correlations between soil metabolomics andbacterial community structures in the pepper rhizosphere under plasticgreenhouse cultivation
译名：塑料大棚辣椒根际土壤代谢组学与细菌群落结构的相关性
期刊：Science of the Total Environment
IF：5.589
发表时间： 2020
通讯作者：宋洋
通讯作者单位：中国科学院南京土壤研究所
实验设计
1.取土：取样点位于山东潍坊一个西瓜和辣椒轮作的PGVC，土壤质地为潮土。从土壤表层20cm深处各取5个根际和非根际土壤样品。抖落法取样根际土壤（根表5 mm范围），非根际土取自远离辣椒（1m内）的土壤。样品用于以下检测。
2.土壤代谢物分析：土壤样品加入提取液—匀浆—冰浴超声—离心—收集上清液—沉淀重复上述步骤—合并上清液—真空干燥—溶剂溶解—上机检测—分析（PCA，气泡图，差异显著分析，与差异微生物关联分析）（详细步骤参数请参照原文）。
3.16S高通量测序：土壤样品DNA提取—细菌16S-V4-V5区扩增—PCR反应—纯化--Illumina Miseq上机测序—分析（PCA，dbRDA，LEfse，PICRUSt）。
4.PAEs检测：加速溶剂萃取法—GCMS检测
实验结果
1土壤性质
土壤性质是影响微生物群落的基础因素。该研究中根际土和非根际土的土壤性质无显著差异(p＞0.05)（表1）。其一，可能是PGVC下土壤普遍施肥的缘故，进而掩盖了根际效应带来的变化。其二，可能是尽管根际释放了大量根系分泌物，但PGVC下土壤微生物对这些可利用碳源消耗极其迅速。因此，根际土DOC含量比非根际土高，但并不显著。这意味着DOC含量并不能精确表征根际土和非根际土的差异。
2土壤PAEs残留
土壤PAEs污染很大程度来源于塑料薄膜覆盖。该研究中检测到的主要PAEs种类是DEHP，DiBP，DnBP（图S1），证实了该土壤PAE污染主要来源于塑料薄膜（地膜）。尽管根际土中16种PAEs总浓度高于非根际土，但PAEs主要种类的浓度在统计学上并无显著差异(p＞0.05)，出现这一结果可能是由于在PGVC中，地膜覆盖了整片土壤。
3土壤代谢物
土壤代谢组学可以对土壤DOC进行高通量、高分辨率解析。该研究中共检出245种代谢物，包括氨基酸，有机酸，碳水化合物，酮类，脂质，醇类等。在这些化合物中，有机酸数量最多，占到所有代谢物的31%，其次是碳水化合物（15%），醇类（11%）和氨基酸（10%）。这些化合物来源于植物根系分泌物、微生物代谢物、植物降解产物、微生物和土壤有机质中，但根际代谢组仍很难区分这些产物具体哪些来自植物，哪些又来自微生物。PCA分析显示根际土代谢物特征与非根际土显著不同，沿第一坐标轴显著分开（图1a）。研究者还计算分析了根际土相对于非根际土的代谢物变化情况，图S2中数据的正趋势表明，根际土中大多数代谢物的丰度高于非根际土，说明了植物根部释放的分泌物可能在根际土代谢物中占据主导地位，但根际土代谢物多样性要略低于非根际土（图S3）。
在检出的245种化合物中，有11种的含量在根际土和非根际土中有显著差异(p＜0.05, VIP＞1)（图S4）。其中，壬酸，麦芽三糖，棕榈酸和麦芽糖显著减少，而蔗糖，丙二酰胺，反油酸，二十四酸，黄体酮，cerotimic acid 和5-Α-胆甾烷-3-酮含量显著增多(p＜0.05)，麦芽糖减少的最多（麦芽糖属于最可被土壤微生物直接利用的根系分泌物能源），黄体酮增加的最多（黄体酮存在于植物细胞中，可以刺激向日葵和小麦根部生长，且微生物也会参与黄体酮代谢）。该研究中根际土和非根际土中主要的差异代谢物是有机酸和糖类（根系分泌物中的有机酸和糖类是根际土壤微生物群落结构转变的主要驱动因素）。
通路富集分析可用于阐明土壤代谢过程中的特异性改变。如图2所示，根际土中变化最显著的通路是淀粉和蔗糖代谢，此外，半乳糖代谢和脂肪酸代谢也显著改变了，这些改变的通路均是碳代谢相关通路。蔗糖来源于高等植物组织，是环境中最丰富的二糖，也是辣椒之类的植物根部释放的最普遍的分泌物。研究表明根际土蔗糖检出量显著高于非根际土。因此，土壤代谢组学可以在分子水平提供根际碳流动的差异化信息。
4细菌群落结构
图S5展示了土壤细菌群落的丰富度和多样性。根际土的Chao和Shannon指数均高于非根际土，但差异不显著(p＞0.05)。一般来讲，根系分泌物招募特定根际促生菌促进植物生长，应该导致根际土壤微生物多样性下降。但在该研究中，由于大量有机和化学肥料的施入，掩盖了根际效应，并未观测到根际土壤微生物多样性的下降。
PCA分析阐明了土壤细菌群落的转变。与土壤代谢组分布特征相似，根际土与非根际土细菌群落沿第一坐标轴显著分开（图1b）。db-RDA分析显示DOC，总钾（TK）和总磷（TP）是驱动土壤细菌群落结构改变的最主要因素（图S6）。在其他PGVC的研究中也报道了DOC对改变土壤细菌群落结构的显著效应(p＜0.05)，证实了DOC发挥的重要作用。据报道土壤有效P和K在辣椒根际微生物群落的转变中显示出相反效果。该研究中P和K对土壤细菌群落的影响也是相反的（图S6）。PAEs也没有显著改变细菌群落结构，与之前对持续20年的PGVC中土壤进行的研究结果一致。
LEfSe分析显示变形菌门和拟杆菌门在根际土中丰度较高(p＜0.05) (图3)。在变形菌门中，根瘤菌目（产生矿化有机质酶促生菌）在根际土中丰度显著较高(p＜0.05)。γ-变形菌纲的黄单胞菌目，β-变形菌纲的伯克霍尔德氏菌目（固氮促生菌）和亚硝化单胞菌目（氮循环相关促生菌）在根际土也具有显著的高丰度(p＜0.05)。因此，辣椒根系分泌物很可能招募了这些具有植物促生作用的高丰度菌属。此外，变形菌门也是使用根系分泌物和积极响应低分子物质的主要族群。在拟杆菌门中，根际土中有丰富的鞘脂杆菌纲（生物分子转化相关菌）和鞘脂杆菌目(p＜0.05)。通常来讲，拟杆菌门在土壤中不是优势菌门，但在根际中却具较高丰度。这可能是由于根际塑造了更适于拟杆菌门生长的环境，拟杆菌门可吸收利用植物的根系分泌物。此外，酸杆菌门的Solibacterales目在根际土中也具有高丰度(p＜0.05)。酸杆菌门丰度的增加一般是有机酸释放，进而pH下降导致的。尽管在该研究中该时间点取样的pH无显著差异，但不意味着PGVC不存在根际pH的动态变化。
根际土与非根际土相比细菌门类相对丰度并无显著下降。一些其他等级的细菌相对丰度在根际土中有显著下降(p＜0.05)，比如热微菌纲，微球菌目，Alicyclobacillaceae环脂酸芽孢杆菌科，甲基杆菌科，链孢囊菌科，间孢囊菌科。一定程度上可能是由于根际富营养细菌（变形菌门和拟杆菌门）丰度的兴起。相反，非根际土壤通常富含k选择的贫营养微生物。
5土壤代谢和细菌群落的相关性
具生物有效性的部分代谢物与土壤微生物群落之间会互相作用。研究土壤代谢和细菌群落的关联性至关重要。为进一步阐明根际差异代谢物和差异微生物之间的关系，构建了互作网络图（图4）。通常，在网络内的代谢物和微生物正相关多于负相关。土壤微生物的节点大小基本相似，表明这些微生物以同等贡献参与了新陈代谢。对于不同代谢物，蔗糖与土壤微生物成分相关性最高（图4），特别是与根际土中高丰度的β-变形菌纲，剑菌属，根瘤菌科，伯克霍尔德氏菌目，变形菌门呈正相关，与微球菌目，norank_O_JG30_KF_CM科和属，热微菌纲，甲基杆菌科，罗尔斯通菌属和微枝型杆菌属丰度呈负相关。因此，可推断那些与蔗糖负相关的根际微生物并不喜欢消耗蔗糖进行生长，而那些正相关的根际微生物可能会释放蔗糖，或在蔗糖消耗量低的情况下爆发生长。第二相关性最高的代谢物是麦芽糖，主要与一些土壤微生物呈负相关。例如，麦芽糖与根瘤菌目，根瘤菌科，叶杆菌科，γ-变形菌纲，黄色单胞菌目和剑菌属呈负相关。这些菌在根际土中丰度升高以及与麦芽糖的负相关关系，表明了这些菌对麦芽糖的高消耗能力。
通过代谢组学分析，得出淀粉和蔗糖代谢通路这些差异代谢通路（图2）。因此，可以将土壤代谢组和细菌群落用功能基因联系起来。PICRUSt显示根际土相比非根际土淀粉和蔗糖代谢功能下调（图S7a）。在这些差异代谢通路中，淀粉和蔗糖代谢功能与差异细菌成分有最大相关性（图S7b）。这证实了在根际土中差异细菌成员通过调控淀粉和蔗糖代谢功能改变了差异代谢物的产生。细菌中蔗糖最重要的代谢通路是外膜到内膜转运蔗糖，蔗糖-6-P的形成，以及蔗糖代谢为果糖或葡萄糖-6-P。蔗糖进入细菌膜后可以直接代谢为葡萄糖-1-P或果糖。图S8基于KEGG数据库描绘了蔗糖淀粉代谢通路和土壤微生物功能基因之间的关系。在这个代谢通路中，蔗糖，果糖，果糖-6-P，葡萄糖，葡萄糖-6-P，麦芽糖等代谢物均被检出。如图S8所示，与非根际土相比，参与上述蔗糖两个主要代谢通路的基因通常在根际土中丰度较低。从这个角度看，对于参与蔗糖主要代谢途径的大多数基因下调表达这一事实，可以一定程度上解释为什么蔗糖在辣椒根际土中积累增多。
6环境启示
根际作为土壤的微环境，是地球上最复杂的生境之一。由于PGVC体系栽培过程中大量施肥和高温高负荷运转，其根际环境更为复杂。DOC（包括根系分泌物）与各种土壤微生物之间的相互作用主导着植物的根际过程。然而，DOC和土壤微生物群落都很复杂，都有数百成员混合构成，这就使对这些系统的分析变得格外困难。高通量测序已成功阐明了土壤微生物群落结构。但通过土壤代谢组学区分DOC化合物仍是一个新兴领域。该研究发现，在PGVC体系下，辣椒根际土和非根际土之间的DOC含量，细菌群落丰富度和多样性没有显著差异。但某些代谢物和细菌类群在根际土中却发生了显著变化。有相似的代谢组学研究报道了相似结果。这项概念性和开创性的研究表明，利用微观和灵敏的技术去分析复杂的环境（例如土壤根际）至关重要。土壤代谢物和微生物群落之间互作关系的明确，将有助于指导植物根际过程的调控，从而结合土壤改良剂或生物技术应用来提高植物产量。值得注意的是，虽然代谢组学可以分析特定条件下特定时间的生物代谢物，但土壤代谢物的动态变化及其与土壤微生物群落结构的相关性还需要进一步的系统研究。
评论
通过土壤代谢组学和高通量测序，展示了辣椒根际土和非根际土中代谢产物，代谢途径以及特异细菌的组成和功能。代谢产物与细菌群落结构密切相关。在PGVC条件下，参与淀粉和蔗糖代谢的功能基因下调导致了辣椒根际土蔗糖丰度的升高。
PGVC：plastic greenhouse vegetable cultivation塑料温室大棚蔬菜栽培体系
DOC：dissolved organic carbon溶解有机碳
PAEs：phthalate esters邻苯二甲酸酯
DEHP：bis (2-n-butoxyethyl) phthalate邻苯二甲酸二辛酯
DiBP：di-isobutyl phthalate邻苯二甲酸二异丁酯
DnBP：di-n-butyl phthalate邻苯二甲酸二正丁酯
PCA：Principal component analysis主成分分析
dbRDA：distance-based redundancy analysis基于距离冗余分析
LEfSe：linear discriminant analysis (LDA) effect size线性判别分析
原文网址：
https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.138439
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