科研| CELL HOST MICROBE：噬菌体对小鼠肠道微生物群和代谢的动态调控

编译：无名者，编辑：谢衣、江舜尧。

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导读

人体肠道微生物群是由包括噬菌体在内的微生物构成的，它们对人体健康起着不可忽视的作用。如果微生物群出现异常，会导致人体出现各种疾病。目前，调整肠道微生物群的方法主要是抗生素治疗和改变饮食，但这些方式会在某种程度上扰乱现有菌群平衡。因此，研究人员认为可以利用噬菌体来更精确和合理地调节肠道细菌。为了探究噬菌体对肠道菌群以及代谢的动态调控的过程，在这项工作中研究人员利用溶解性噬菌体侵染定植了一组已知人类共生菌的小鼠，并使用高通量测序和qPCR纵向跟踪了每种微生物的反应。结果表明，在肠道中特定噬菌体会引起易感菌群的靶向裂解，并通过细菌间相互作用进一步调节细菌，导致这些非靶标菌群的大量繁殖或减少。代谢组分析表明，噬菌体捕食引起的细菌的组成变化也同时引起肠道代谢物的变化，有约17%的代谢物收到影响。本研究深入探究了噬菌体作为肠道菌群“调节器”的生态重要性，并另外暗示了肠道噬菌体对哺乳动物宿主的潜在影响。该结果对于利用噬菌体调节微生物群、治疗疾病等方面有着重大参考意义。

论文ID

原名：Dynamic Modulationof the Gut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model

译名：噬菌体对小鼠肠道微生物群和代谢的动态调控

期刊：Cell Host &Microbe

IF：15.753

发表时间：2019.6.12

通讯作者：Pamela A.Silver&Georg K. Gerber

通讯作者单位：哈佛大学、哈佛医学院

实验设计

本文将十种存在于人体内的兼性厌氧和专性厌氧细菌（Akkermansiamuciniphila, Bacteroides fragilis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus,Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli Nissle 1917, Klebsiellaoxytoca, Parabacteroides distasonis, Proteus mirabilis）定植于无菌小鼠中来构建明确微生物群落的限菌小鼠模型。在上述十种细菌中选取靶向四种细菌的裂解性噬菌体并引入限菌小鼠中，分别为E. coli 的T4噬菌体、C. sporogenes的F1噬菌体、B. fragilis的B40-8噬菌体和E. faecalis的VD13噬菌体。首先通过斑点试验（spot assay）测试噬菌体对特定细菌的裂解特异性。然后将四种噬菌体两两成对（每对同时包含针对厌氧和兼性厌氧细菌的噬菌体），引入已构建好的限菌小鼠中，并在引入前后收集粪便样品。接着，利用噬菌体特异引物进行qPCR估算噬菌体丰度，以16S rRNA扩增子测序获得的相对丰度和使用通用16S rRNA引物通过qPCR测量的总细菌丰度（根据E.coli Nissle 1971标准曲线测量）的乘积来评估每种细菌在噬菌体引入前后的浓度。其次，根据上述已获得的细菌丰度数据，利用R的vegan包来计算Bray Curtis相异度(dissimilarity)，评估噬菌体引入后小鼠体内微生物群的稳定性。根据以上两步来确定靶向菌群和非靶向菌群的丰度是否发生变化，并以此来推断可能的级联效应和菌群互作网络。最后，制备上述小鼠粪便样品以用于代谢组分析。样品分为五等分，四个等分用于不同条件的分析，一等分作为备用，利用UPLC-MS/MS经过与标准品比较来鉴定和定量化合物，分析各代谢物的动态变化。

实验结果

1.噬菌体对代表性人体肠道共生菌具有个体特异性

我们首先利用十种常见的人体肠道细菌定植于无菌小鼠中，构建模拟人体肠道微生物群落的模型。其次选取捕食其中四种细菌的噬菌体，测试噬菌体限菌小鼠共生细菌的裂解能力来验证噬菌体特异性。使用斑点试验（spot assay），测试了每种细菌对5毫升相应裂性噬菌体的敏感性(~109 pfu/毫升)。在37℃需氧或厌氧培养后，我们发现T4噬菌体、F1噬菌体、B40-8噬菌体和VD13噬菌体只靶向裂解相应细菌，对其他共生细菌没有明显影响。

图1 哺乳动物肠道噬菌体行为的纵向表征。(A) 将单独饲养的无菌C57BI/6小鼠(n = 5)经口服管胃含有2×10⁶至2×10⁷ cfu的细菌混合物。在第16.1天和第30.1天，用NaHCO₃灌胃以中和胃酸，随后每种噬菌体饲喂2×10⁶ pfu。在整个实验过程中定期收集粪便样本，使用分子方法定量细菌和噬菌体。(B)每种噬菌体和靶向细菌的浓度分别显示为(每克粪便中估计噬菌体)和(每克粪便中估计的cfu)。数据点代表每只老鼠(n = 5)时间匹配样本的几何平均值标准差。y轴的浓度以log₁₀显示。(C)来自小鼠(n = 5)的选定样品中粪肠球菌的数量和体外测定的抗VD13噬菌体裂解的菌落百分比(平均标准差)。

2.噬菌体在哺乳动物肠道中捕食并与靶向噬菌体共存，导致敏感和抗性细菌的混合种群。

通过qPCR和高通量测序的方法，我们获得了在噬菌体施加前后，噬菌体和细菌种群的数量浓度变化。分析表明，噬菌体和它们相应的共生菌共存于肠道中。引入噬菌体4-6h后，每种噬菌体都可以检测到并在以后实验中持续存在（图1B）。先前的研究表明，在没有敏感细菌的情况下给无菌小鼠注射的T4噬菌体，在两天内就会脱落。鉴于此，我们感兴趣的是确定在定植于小鼠的细菌是否获得了对噬菌体的抗性。因为细菌群落既含有多样性的菌株也包含密切相关的菌株，从粪便中分离单个菌株来测定噬菌体抗性是困难的。然而，使用选择性培养基，我们能够从粪便中分离E. faecalis，并测定其对VD13噬菌体的敏感性。如图1C所示，在噬菌体引入前(27.1天)和之后 (30.5天)，E. faecalis对噬菌体是敏感的(敏感性极限，1.6%)。然而，在2天(32.3天)和10天(40.2天)后，发现分别有28%和68%的被测菌落产生噬菌体抗性。当与E. faecalis 浓度的变化一起考虑时，表明噬菌体定向敲低（knockdown）细菌(~ 2个数量级)导致抗噬菌体亚群的富集。

3.噬菌体在微生物群中诱导非靶向细菌的级联效应

通过纵向跟踪每种细菌发现噬菌体不仅影响靶向菌群还导致噬菌体不敏感的细菌物种数量变化。当根据估算的菌群浓度检查细菌组成时(图2A)，发现引入噬菌体会导致微生物群中低丰度和高丰度的细菌发生转变。为了量化加入噬菌体后细菌定殖情况的变化，我们计算了每种噬菌体施加后与前一天相比细菌群落浓度的变化（图2B）。我们发现，在第一组噬菌体施加期间，C. sporogenes和E. coli 的敲低导致B. vulgatus，P. mirabilis和A. muciniphila 快速繁殖，然后是P. distasonis 和B. ovatus种群的扩大，以及B. fragilis数量的逐渐减少。第二组噬菌体对微生物组的影响不显著，E. coli 和C. sporogenes的扩张程度最小，其他物种在基线附近波动。根据Bray-Curtis差异度（dissimilarity），我们发现随着噬菌体加入，小鼠之间和相邻时间点之间的差异度逐渐缩小。这间接地表明微生物群在形成一个更稳定的系统，噬菌体捕食可能有利于细菌群落的稳定性。 

图2 噬菌体对共生肠道菌群的影响。(A)估计的粪便中的细菌数量，下图是上方全尺寸图的放大版本。来自单独饲养小鼠(n = 5)的每种细菌估计的细菌浓度的几何平均值显示在堆叠条形图中，y轴为线性刻度。(B, C)每种细菌物种的丰度取对数 (log₁₀)，数据来源于图2A，由引入第一组噬菌体(B)和第二组噬菌体(C)而产生的变化。x轴代表噬菌体引入后经过的时间，垂直虚线表示当噬菌体施加时t = 0。

4.噬菌体靶向细菌的缺失实验描述了细菌相互作用的因果关系

我们通过比较有无靶向噬菌体引入下小鼠体内菌群定殖情况，揭示其对微生物群可量化的影响。如图3A中，当物种1存在（完全聚生体, full consortium）和物种1不存在时 (细菌缺失，bacterial dropout)，可以洞察其对其他微生物的促进和抑制作用。噬菌体捕食导致进一步细菌敲低，其效果接近细菌缺失。因此，选用聚生体中九种细菌来定殖无菌小鼠，依次缺失每种噬菌体的靶向细菌(图3B)。如图3C所示，尽管在定殖过程中总体平均细菌密度相似，但每一组小鼠都显示出显著的组成差异。在某些情况下，噬菌体敲低可以与细菌缺失效果类似，例如T4噬菌体，在引入后会立即显著减少E. coli 的数量。如假设的互作网络所示(图4A)，E. coli 很可能通过细菌相互作用促进B. fragilis并抑制B. vulgatus，因此其被第一组噬菌体敲低会导致B. fragilis的减少和B. vulgatus的增多。在施加第二组针对E. faecalis和B. fragilis 的噬菌体后，我们发现对周围微生物群落的定殖影响相对较小(图2C)。因此，引入第二组噬菌体会同时降低这两种被噬菌体捕食菌群，这可能抵消抑制或促进的效应，导致对整个细菌集合定殖的影响忽略不计。总之，这些结果表明细菌种群噬菌体之间存在着广泛且深入的相互作用。 

图3 细菌脱落对群落定殖的影响。(A)细菌脱落群体中个体物种(物种1)的缺失对周围微生物群落定殖密度的影响示意图。 “完全聚生体（Full consortium）”，描述了细菌物种1、2和3的浓度。而“细菌敲低（Bacterial knockdown）”和“细菌缺失（'Bacterial dropout）”描述了物种1减少和消除时，对物种2和物种3的分级影响。(B)为了确定细菌群落中细菌脱落的影响，四组五只单独饲养的无菌C57Bl/6小鼠被口服灌胃含有九种最初十种细菌群落的细菌混合物，依次缺失E. coli, C. sporogenes,B. fragilis和E. faecalis。(C)完整或细菌缺失群落的估计总定殖密度显示在堆叠柱状图中，上图为完整比例，下图为放大比例以显示低丰度物种。y轴以线性比例显示，每种细菌的浓度是从每组小鼠(n = 5)计算的几何平均值。(D)在第16.1天，细菌缺失群落中每个细菌物种对数(log₁₀)变换定殖相对倍数变化。每个条代表平均标准差。

图4 肠道微生物群中细菌的相互作用网络。假设的相互作用网络来源于完整的10中细菌之间的定殖差异和长期定殖后噬菌体靶向细菌的脱落(第16.1天)，如图3D所示。(A，B)代表E. coli与C. sporogenes (A)E. faecalis与B. fragilis(B)的相互作用网络。线宽对应于细菌脱落诱导的定殖密度变化，即log₁₀变换，实线终止于箭头，表示假设的促进作用，虚线终止于正交线，表示假设的抑制作用。(C，D)在施用第一组噬菌体(T4和F1)，分别靶向E. coli和C. sporogenes (C)后，和施用第二组噬菌体(B40-8和VD13)，分别靶向B. fragilis 和E. faecalis (D)后，在选定的时间点(0.3天、2天和13天)，来自完全聚生体(来自图2的数据)定植的小鼠的每种物种浓度的log₁₀变换。条形代表平均标准差。

5.噬菌体诱导的细菌调节影响了肠道代谢组

我们试图通过肠道代谢组的变化来描述噬菌体捕食对微生物组的功能效应。使用非靶向代谢组学，我们研究了小鼠不同阶段的粪便代谢物，即在无菌状态下，引入细菌定殖后和施加噬菌体后（图5A）。结果表明，噬菌体诱导的肠道微生物组重建对代谢物的影响较小。第一组噬菌体的引入导致17%的化合物发生显著的变化，这些代谢物几乎存在于所有的KEGG途径，例如，氨基酸、肽、碳水化合物、脂质、核苷酸、辅因子、维生素和异生物质(图5B)。第二组噬菌体的对代谢产物数量方面没有较大的影响 (图5C)，微生物群落的变化主要是施加噬菌体13天后E. faecalis 的减少(图5E)。相比之下，将细菌引入无菌小鼠后，粪便代谢组发生了广泛的变化，所有KEGG途径中共860种代谢物中的60% (514种代谢物）增加，15% (127种代谢物)减少。这些结果表明代谢组学受影响的程度反映了肠道微生物群组分变化的程度。

6.噬菌体可以调节与特定细菌特有的神经递质代谢物

我们观察到，噬菌体对细菌的特异性会减少相关的代谢产物。例如，色胺是一种通常来源于植物的神经递质，但也可以由少量的共生肠道细菌通过色氨酸脱羧途径产生。到目前为止仅在两个具有遗传特征的物种中被鉴定，即R. gnavus和C. sporogenes，后者存在于我们定殖的细菌聚生体中。在第一组噬菌体施加期间，我们检测到色胺分别在0.3、2和13天降低了10、17和2倍，如图5F所示的氨基酸途径所示。这分别对应于C. sporogenes 降低840倍、4倍和4倍(图5D)。神经递质酪胺是由E. faecalis通过酪氨酸脱羧（tyrosine decarboxylation）产生的。施加第二组噬菌体导致酪胺（tyramine）减少4、2.7和4倍(分别在0.3、2和13天)，如图5G的氨基酸途径所示。这相对应于E. faecalis 分别减少了1.3倍、9倍和42倍(图5E)。色胺和酪胺分别与C. sporogenes和E. faecalis的独特关联表明噬菌体、细菌和代谢物之间存在明显的因果联系。

7.噬菌体可以通过已知的哺乳动物宿主效应调节与多种细菌相关的代谢产物

第一组噬菌体的引入增加了丝氨酸和苏氨酸在粪便中的浓度。这两种氨基酸是O-糖基化肠粘蛋白中最具代表性的氨基酸重要成分。我们还发现由于第一组噬菌体的施加，胆盐也发生了显著变化。哺乳动物产生的牛磺和糖结合的初级胆盐会经过微生物转化，包括胆汁盐水解酶对氨基酸去结合和羟基类固醇脱氢酶的脱氢。第一对噬菌体对细菌群落的调节增加了去结合胆盐，并减少结合胆盐 (图5F)。这表明胆汁盐水解酶活性增加，我们发现这主要与细菌聚生体(B. fragilis, B. ovatus, B. vulgatus, C.sporogenes, E. faecalis, E. coli, P. distasonis 和P. mirabilis)有关。我们还检测到两种去结合次级胆盐的增加，这两种胆盐在无菌小鼠中没有检测到，因此可能是微生物衍生的12-脱氢胆酸盐和熊胆酸。前者由12a-羟基类固醇脱氢酶的活动产生，而后者由7a-羟基类固醇脱氢酶和7b-羟基类固醇脱氢酶连续活动产生。每种酶都与B. fragilis, C. sporogenes和E. coli 相关，这三种细菌在第一组噬菌体引入后减少。这部分结果表明微生物群的波动会导致与宿主生理活动相关化合物的变化。 

图5 粪便代谢组分析。(A)从确定的细菌群落定殖的无菌(GF)小鼠收集粪便样品，然后用第一组噬菌体(T4和F1)和第二组噬菌体(VD13和B40-8) (n = 5)处理。为了确定粪便代谢物浓度的相对变化，测量的代谢物量被标准化为扰动(如噬菌体给药)前样品的量。具体的粪便样本用圆圈表示，比较用箭头表示。(B，C)火山图显示在施用第一组噬菌体(B)13天后，每种代谢物的显著性(y轴)相对于倍数变化(x轴)增加，在施用第二组噬菌体(C)13天后，每种代谢物的显著性相对于倍数变化(x轴)增加。水平虚线上方的点表示错误发现率调整后p值< 0.05的显著变化。(D，E)为了帮助直接比较每种代谢物相对于细菌群落的变化，对细菌浓度(细菌数目/g粪便)的平均倍数变化进行分级聚类。在引入第一组噬菌体(D)和第二组噬菌体(E)后，用log₂比例的热图显示。(F，G)在引入第一组噬菌体(F)和第二组噬菌体(G)后，用log₂比例的热图对显著变化的代谢物(经FDR调整的p值< 0.05)的分级聚类。无菌(GF)小鼠中每种代谢物存在的截止时间是在5只小鼠中的至少4只中检测到的。本文中讨论的代谢物以粗体显示。

讨论

我们的结果表明，裂解性噬菌体不仅捕食靶向细菌，还通过级联效应影响肠道中非特异细菌物种。我们的研究展示了一个动态的微生物群落，其中裂解性噬菌体与靶向细菌共存并特异捕食，然后通过影响微生物群的其他细菌，最终调节肠道代谢组。

根据先前的研究，虽然有人提出噬菌体对系统发育成分的影响微乎其微，但是先前所采用的NGS测序结果仅建立在“属”水平上，这可能掩盖了物种水平的变化。另一项研究利用无菌小鼠的结果表明，噬菌体引入会导致小鼠肠道微生物群组成发生改变。但是他们使用的是一系列不确定的噬菌体，无法在体外验证噬菌体在细菌聚生体中的感染能力。并且他们以相对浓度而非绝对浓度跟踪肠道菌群，这就很难研究清楚捕食过程中的直接影响和间接影响。通过噬菌体和细菌相互作用的体外验证，我们可以将噬菌体靶向捕食细菌的影响和随后通过微生物间相互作用对菌群的影响区分开。

虽然通常通过物种或菌株对细菌的特定影响来看待噬菌体捕食，但我们的结果考虑了细菌群落内细菌间相互作用和潜在级联效应的重要性。尽管细菌间的相互作用显然很重要，但鉴于目前可用的方法有限，在体内进行实验鉴定和确认比较困难难。在分子生物学中，确认基因作用的一般策略是利用基因敲除来验证功能丧失，然后通过将基因重新引入敲除来验证功能获得。我们的结果表明，噬菌体可以以级联的方式为微生物群提供类似的功能。

选择合适的噬菌体可以选择性地调节某些菌群，同时将对周围微生物群的级联影响降至最低。例如，E. faecalis和B. fragilis捕食相应细菌引起微生物群落中最小的级联反应。尽管在定殖密度上，E. faecalis (~10⁵，每克粪便中的细菌数)和B. fragilis (~10⁷，每克粪便中的细菌数）存在巨大的差异。一种可能性是先引入E. coli和C. sporogenes的噬菌体会抑制菌群对随后施加的B. fragilis和E. faecalis噬菌体的反应。我们更倾向于另一种情况，即B. fragilis和E. faecalis的级联效应部分地抵消，这可以通过我们从菌群缺失实验中得到的细菌间相互作用网络来解释。低丰度物种也可以产生强大的影响，例如低丰度的Clostridium scindens抑制Clostridioidies difficile感染。我们的结果表明，这种影响可能发生在共生菌中。这就引出了一个后续问题，即这些细菌如何介导其在哺乳动物肠道生态系统的影响。除了交叉相互作用，抗菌肽、群体感应和营养竞争等直接相互作用以外，细菌还可以通过宿主来改变局部环境，例如通过炎症。总的来说，我们的发现表明，具有适当的噬菌体可以作为研究微生物组动力学和相互作用的工具，提供持续的敲低或精确的瞬时扰动。

我们的结果还表明，肠道微生物组中的噬菌体捕食对哺乳动物宿主有潜在的影响，如肠道代谢组的调节来所示。由于微生物代谢物在介导细菌与哺乳动物宿主之间的相互作用中起着重要作用，噬菌体与微生物代谢物之间的联系提供了一种可能的治疗思路。其他细菌调节方法，如抗生素，可能对微生物代谢产生长远和不可预测的影响。相比之下，噬菌体可以引发细菌靶向效应，例如，通过噬菌体对减少色胺的C. sporogenes 的捕食可以加速胃流动性，而捕食E. faecalis可以减少酪胺并诱导回肠收缩。尽管表征肠道微生物的代谢仍需要大量工作，但噬菌体定向细菌敲除可能是合理调节微生物代谢以达到治疗目的的潜在途径。

噬菌体和细菌的纵向跟踪使我们能够观察噬菌体在肠道微生物群中的捕食动态。我们的发现之一是裂解性噬菌体在肠道中持续存在，被靶向的细菌经历了敲低而不是缺失。过去的研究表明，在哺乳动物肠道中T4噬菌体可以与靶向细菌共存并以此繁殖数周。有趣的是，T4噬菌体和一种类T4噬菌体ED6在用E. coli 单一定殖的小鼠中仅共存一至两天，而另一种靶向E. coli的裂解性噬菌体T7却持续数周。综上所述，这些结果表明背景菌群可能是通过细菌间的相互作用来维持噬菌体在肠道中繁殖和共存的。

之前已经有报道称，由于遗传或生态抗性机制，噬菌体不能完全根除靶向细菌。在本研究中，我们发现引入E. faecalis的噬菌体会导致在最初的一些噬菌体敏感菌株中出现噬菌体抗性突变。先前的工作表明Vibrio cholerae对其噬菌体遗传抗性的产生与适应性受损相一致，允许敏感菌株持续存在，从而繁殖噬菌体。在体外和其他生态系统中已经观察到类似的适合性成本抗性，这可以解释为什么在人类肠道病毒中几乎没有观察到细菌抗性和噬菌体捕食之存在协同进化。一些其他机制，例如细菌在物理上无法接触噬菌体的生态抗性，也可以解释为什么一些噬菌体敏感细菌会在肠道中持续存在。此外，体外研究表明，噬菌体在粘膜表面的扩散减少，与管腔相比，肠粘膜中的噬菌体感染动态可能发生改变，这可能解释了B. fragilis噬菌体捕食的差异。与大肠杆菌相比，这些物种在肠道粘膜上具有更大的向性，而大肠杆菌通常在管腔中更多见

微生物的复杂性和多样性及其在肠道中的相互作用对实验提出了巨大的挑战。每个人的肠道微生物组都是独特的，通常是由无法培养且难以进行系统发育分类的微生物组成，且受到生活方式，药物，饮食和环境因素的干扰以及哺乳动物宿主的相互影响。因此，要理解人类肠道微生物组的复杂生物过程，必须在还原人体肠道微生物组与实验的可行性之间做出折衷。我们使用定殖有十种可培养并具有特征的人类共生菌株的遗传近交限菌小鼠模型，包括适度的复杂性和细菌多样性，同时将潜在的混杂变量降至最低。我们发现裂解噬菌体可以在肠道菌群中发挥重要作用，但这仅仅是它们潜在功能的一个方面，因为它们具有多种生活方式（例如，溶源噬菌体）、对不同细菌物种的感染能力、对细菌的潜在感染力和水平基因转移。此外，尽管噬菌体通常在细菌物种之间具有狭窄的感染范围，但是它们可以在相同物种的菌株之间显示出广泛的侵染性。因此，该领域的重要目标将是在常规小鼠或人群中开发在完整的微生物群的情况下表征噬菌体作用的方法。通过阐明噬菌体和肠道细菌之间的动力学关系，并简化了肠道环境，我们的工作提供了一个在复杂条件下进行深入研究的框架，并以此阐明噬菌体，微生物群以及宿主健康与疾病之间的相互作用。

评论

人体肠道微生物群对人类的健康有着重要影响，肠道菌群失调可能会导致各类疾病。本文通过构建限菌小鼠模型，利用四种噬菌体定向裂解四种细菌来探究噬菌体与肠道细菌之间的关系以及细菌之间的相互作用和代谢调控。结果充分说明了噬菌体对靶向和非靶向细菌的影响，以及细菌之间的级联关系。最后，分析了噬菌体引入后各类代谢化合物的改变。这为以后研究噬菌体在肠道中的作用提供了一个新思路，并为调节肠道微生物群和治疗相应疾病阐明了一个新途径。

原文网址：https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.001