编译：荔枝，编辑：谢衣、江舜尧。
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围产期接触双酚A (BPA)可导致子代神经系统疾病，但其潜在机制仍知之甚少。色氨酸(TRP)和多巴胺(DA)通路中的神经活性代谢物异常释放被认为与某些疾病密切相关。因此，在本研究中，作者研究了从妊娠第6天到断奶期间，给予怀孕小鼠BPA(2,10，或100 μg /kg/d)的情况下，探究对成年雌性小鼠后代的TRP和DA通路的影响。分别于3个月、6个月和9个月收集幼仔血清和大脑样本，检测TRP和DA通路中的12种神经活性代谢物。结果表明，在TRP通路中，TRP水平下降，然而大脑中的犬尿氨酸(KYN)水平和TRP转化率却增加。在血清中，TRP、KYN和5-羟色胺(5-HT)的水平明显降低。对于DA代谢途径，DA和DA代谢物，包括3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC)，3-methoxytyramine(3-MT)和高香草酸(HVA)的水平在大脑和血清中都明显减少。DA转化率在脑内显著降低，在血清中却升高。这两条代谢途径的紊乱可能是BPA诱导的神经疾病的潜在机制之一。
论文ID
原名：Perinatal exposure to bisphenol A causes a disturbance of neurotransmitter metabolic pathways in female mouse offspring: A focus on the tryptophan and dopamine pathways
译名：围产期接触BPA会干扰雌性小鼠子代的神经递质代谢途径：主要集中在色氨酸和多巴胺途径上
期刊：Chemosphere
IF：5.778
发表时间：2020.4
通讯作者：高蓉、余静
通讯作者单位：南京医科大学
实验设计
本实验所用小鼠为SPF级C57B/6J品系，雌雄均为10-12周龄性成熟小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物饲养于人工控制条件下，室温18-22℃，湿度30-50%，光照周期为12小时光照，12小时黑暗。自由取食饮水，饲料中不含大豆等含植物雌激素物质，全程使用玻璃饮水瓶和不含BPA的聚丙烯饲养笼。小鼠雌雄分笼喂养，适应性喂养7天，之后进行笼内交配。检查出阴拴者定为交配成功F0代孕鼠，并将见栓当日记录为妊娠第一天(P1)。F0孕鼠每组10-12只，给药方式为皮下注射，每天一次连续给药，剂量为：0，2，10，100μgBPA /kg/d，从P6到出生后21天(PND21)。子代F1正常分娩，在出生第七天，挑选出一定数量的雌性幼崽。(Control (A), n = 34; 2 μgBPA /kg/d (B), n =37; 10 μgBPA /kg/d (C),n= 40; 100 μgBPA /kg/d (D),n = 44)。雌性幼鼠在PND 21时断奶，每笼饲养3-5只老鼠。当小鼠3月龄(3 M)、6月龄(6 M)、9月龄(9 M)时，处死F1雌性小鼠。收集血清和大脑组织样本并储存在-80℃中。用UHPLC-MS/MS检测TRP和DA通路里的12种神经活性代谢物。所有神经活性代谢物水平均以mean±SD表示。采用SPSS25.0统计软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。如果单因素方差分析显示了整体的显著性，则使用事后两两比较(Dunnett’s test)来比较对照组和BPA处理组。组间差异有统计学意义(p < 0.05)。用MetaboAnalyst 4.0进行主成分分析(PCA)，正交偏最小二乘判别式(OPLS-DA)用于多元统计分析。
实验结果
图1. 本研究从色氨酸途径(A)和多巴胺途径(B)研究单胺类神经递质。
单胺类神经递质：TRP，色氨酸；KYN，犬尿氨酸；3-HK: 3-羟基犬尿酸; 3-HAA: 3-羟基邻氨基苯甲酸; 5-HT: 5-羟色胺; 5-HIAA: 5-羟吲哚乙酸; DA: 多巴胺; DOPAC: 3, 4-二羟基苯基乙酸; 3-MT: 3-甲氧酪胺; HVA:高香草酸; NE: 去甲肾上腺素; E: 肾上腺素. 酶类有: TDO: 色氨酸2,3-二加氧酶; IDO: 吲哚按2,3-二加氧酶; KMO:犬尿氨酸单加氧酶; KYNU:犬尿氨酸酶; TPH:色氨酸羟化酶; MAO:单胺氧化酶; COMT: 儿茶酚邻甲基转移酶; DBH: 多巴胺羟化酶; PNMT: 苯乙醇胺N-甲基转移酶。
1、 PCA和OPLS-DA用于多元线性分析
采用PCA研究围产期BPA处理以后3、6、9月龄子代大脑中神经活性代谢物的变化（图2），基于UHPLC-MS/MS测定的神经活性代谢物水平（表1）。
图2. 基于大脑中的12种神经活性代谢物对对照组和BPA处理组3,6,9月(B: 2 μgBPA /kg/d; C: 10 μgBPA /kg/d; D: 100 μgBPA /kg/d)的PCA分析图。彩色圆圈代表95%的置信区间。
表1. 围产期暴露于2，10和100μgBPA /kg/d的3M、6M和9M雌性小鼠幼仔脑样本中单胺类神经递质浓度[ng/g, mean ± SD].
图3显示基于UHPLC-MS/MS数据的血清样本的PCA分析图（表2）。
图3. 基于血清中的12种神经活性代谢物对对照组和BPA处理组3,6,9月(B: 2 μgBPA /kg/d; C: 10 μgBPA /kg/d; D: 100 μgBPA /kg/d)的PCA分析图。彩色圆圈代表95%的置信区间。
表2. 围产期暴露于2，10和100 μgBPA /kg/d的3M、6M和9M雌性小鼠幼仔血清样本中单胺类神经递质浓度[ng/g, mean ± SD].
在对照组和BPA处理组之间可以发现一个相对清晰的分离，特别是在3M高剂量组(100μgBPA /kg/d)和9M所有浓度处理组。血清样本中，在3M高剂量处理组和9M高剂量和中等剂量(10μgBPA /kg/d)处理组中，对照组和BPA处理组的也分离开。此外另一种方法，OPLS-DA，用于分离造成大脑和血清对照组和治疗组之间差异的变量。在OPLS-DA模型中，各组之间的区别更加明显。这些结果初步表明BPA可以改变神经递质代谢途径。
2、 神经活性代谢物水平的多重比较
如表1所示，我们检测了经过BPA处理的雌性小鼠后代的大脑样本中的12种神经活性代谢物。在TRP途径(表1)，和对照组相比，TRP水平在3M的中高处理组和9M的所有BPA处理组中显著降低，然而，KYN的水平在9M的高剂量处理组提高。对于DA途径(表1)，在9M的低剂量和中等剂量处理组中，DA显著减少，在3M的高剂量处理组中DOPAC和HVA显著减少。值得注意的是，3M高剂量、6M中剂量和高剂量以及9M三次剂量均发现3-MT水平显著下降。
从表2可知，在TRP通路中，3M和6M没有显著区别；然而，在9M高剂量处理组的TRP通路中发现TRP、KYN和5-HT的显著变化。对于DA途径（表2），在3M高剂量处理组和9M的中高剂量处理组中DA水平显著降低，而DOPAC的水平只在9M的高处理组中显著减少。另外，在3M的高剂量组和9M的中剂量处理组中HVA的水平显著降低。
3、 神经递质代谢通路的多重比较
TRP途径中，9M高剂量处理组中，KYN/TRP和5-HT/TRP的比例和对照组相比显著增加（图4），这表明BPA可以激活TRP的降解。
图4. 大脑色氨酸通路中的对照组和BPA处理组的产物神经递质/前提神经递质的比值盒图(B: 2 μgBPA /kg/d; C: 10 μgBPA /kg/d; D: 100 μgBPA /kg/d)。*P<0.05, ***P < 0.001 by Dunnett’s test.
对于DA通路，如图5所示。在9M高剂量组和6M中高剂量处理组中发现DOPAC/DA和3-MT/DA比例的显著降低；然而，在9M和6M的中等剂量处理组中发现HVA/3-MT比值的增高。这些结果主要反映了DA和DA代谢物转化率的变化。
图5. 大脑多巴胺通路中的对照组和BPA处理组的产物神经递质/前提神经递质的比值盒图(B: 2 μgBPA /kg/d;C: 10 μgBPA /kg/d;D: 100 μgBPA /kg/d)。*P<0.05, ***P < 0.01 by Dunnett’s test.
图6显示了TRP通路中TRP及其代谢产物转化率的显著改变。只有在9M高剂量处理组中3-HAA/KYN的比例才显著增加。值得注意的是，在5-HIAA/5-HT的比例中观察到一个相反的现象，在6M的低中高剂量处理组中，5-HIAA/5-HT的比例显著减少，然而，在9M的高剂量处理组中它显著增加。另外，5-HT/TRP比值在6M低剂量和9M高剂量时均有明显升高。
图6. 血清色氨酸通路中的对照组和BPA处理组的产物神经递质/前提神经递质的比值盒图(B: 2 μgBPA /kg/d;C: 10 μgBPA /kg/d;D: 100 μgBPA /kg/d)。*P<0.05, **P<0.01, ***P < 0.001 by Dunnett’s test.
另外，如图7所示，在DA通路中也发现了几个具有统计学意义的差异。具体地说，在9M中、高剂量时，DOPAC/DA的比例显著增加。在9M的高剂量处理组中HVD/DA显著增加，在3M的中高剂量处理组中，HVA/DOPAC的比例显著减少。这些结果表明BPA暴露影响了雌性小鼠后代DA通路的转化。
讨论
KYN代谢是TRP两个代谢途径之一。在目前的工作中，TRP水平在脑和血清中均明显下降。值得注意的是，9 M 处理组中，KYN水平在脑内升高，而在血清中降低，表明KYN水平在中枢系统和外围系统受到不同程度的影响。IDO和TDO，这两种主要的限制性内切酶都参与了TRP向KYN的转化。9M成年雌性小鼠后代的KYN/TRP比值增加，这表明IDO或TDO可能被激活。这一结果与接触BPA后TDO-2的mRNA水平显著上调相一致。KYN/TRP比值异常与多种神经系统疾病有关。例如，与健康对照组相比，帕金森患者的脑脊液和血清中的KYN/TRP比值增加。KYN的中间代谢物，如3-HK和3-HAA，表现出神经毒性活动，并在神经退行性过程的启动、发展和扩增中发挥重要作用。本研究发现BPA暴露可导致3-HAA/3-HK比值升高，提示BPA可能干扰KYNU活性。
5-HT是TRP代谢通路的另一个代谢途径，在情绪行为和精神疾病中起着至关重要的作用。TRP是一种必需氨基酸，在5-HT和5-HIAA的生物合成中起重要作用。在BPA处理组的9M中观察到5-HT水平显著下降。这表明BPA的长期作用导致了5-HT代谢的异常。特别是大脑和血清中5-HT/TRP比值的降低表明代谢酶水平的降低，如TPH。结果也表明在6M的BPA三种剂量处理组中5-HIAA/5-HT的比例显著减少。这种差异可能是由于BPA对5-HT代谢的年龄依赖性影响。一些研究表明BPA对5-HT的合成和代谢有不利影响；然而，这些研究集中在新生儿和青少年阶段。在9周龄雌性大鼠的后代中，5-HIAA水平和5-HIAA/5-HT比值显著降低；而在14-15周龄的成年小鼠中，在围产期接触BPA后，5-HT和5-HIAA水平升高。这些神经递质的改变可能至少部分地归因于调节相应代谢途径的基因的异常表达，例如，BPA显著增加了幼年雌鱼大脑TPH 的mRNA含量。
对于DA通路，本研究测定了DA和DA代谢物的水平，例如，DOPAC，3-MT，HVA，NE和E。一些关键的酶参与了DA通路，例如，COMT，MAO，DBH，PNMT和TH参与DA和生物合成。在目前的工作中，DA和DA代谢物发生了显著的变化。例如，DA、DOPAC和HVA在大脑和血清中的水平均显著下降。此外，DA转化率在脑内明显降低，而在血清中升高。具体表现为，大脑中DOPAC/DA和3-MT/DA的比例显著降低，但是DOPAC/DA和HVA/DA的比例在血清中的比例增加。
DA在运动控制、情绪和神经内分泌系统中具有重要的生理作用，DA的缺乏与帕金森病等神经疾病相关。此外，HVA是DA的稳定降解产物之一，HVA水平降低提示DA通路活性降低。在9周大的雄性后代中，产前接触BPA使DA水平增加，大脑多个区域的DOPAC/DA的比值降低。此外，在延髓中，将DA代谢成多巴胺的MAO-B活性降低。雄性新生大鼠在出生后第2天注射BPA后，纹状体中的DA和DOPAC水平在28 天时升高。此外，有几项研究也指出BPA影响DA系统相关基因，并可能产生负面影响。在非人类灵长类动物中，胎儿产前接触低剂量的BPA后，多巴胺表达明显减少，这一点支持BPA对DA代谢的不良影响。
值得注意的是，3M，6M和9M处理组大脑中3-MT显著下降，6M和9M中DA到3-MT的转化率显著降低。3-MT是细胞外DA代谢的主要产物，通常被认为是一种不具有生物活性的化合物，参与多种生理活动。在目前的研究中，我们发现围产期接触BPA会导致3-MT显著减少，3-MT减少对生理活动的不利影响需要进一步研究。
有趣的是，在9M，雌性小鼠中，被BPA处理后，TRP和DA的代谢通路表现出了显而易见的改变。对这种年龄依赖性差异的合理解释，可能与年龄对雌激素的影响有关，而雌激素具有神经保护作用。因此，我们推测，雌激素水平作为关键因素，可能与围产期接触BPA有关，目前需要更多的研究来充分阐明BPA诱导的神经递质紊乱的分子机制。
在母体血清、羊水、胎儿脐带血清和破乳中都能检测到BPA，这提示围产期持续接触的BPA，可能来自于各种资源。我们的发现为围产期长期接触BPA的后果提供了额外的支持，并表明BPA会导致血清和大脑中TRP和DA通路的紊乱。因此，围产期减少接触BPA可以降低后代患神经或精神疾病的风险。
结论
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2020.12671
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