编译：王艳林，编辑：小白、江舜尧。
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多环芳烃（PAH）是农田中最普遍的持久性有机污染物之一，负面影响土壤微生物组功能，例如碳和养分循环以及能量代谢。PAH对土壤生态环境的破坏极大地限制了土壤的使用，特别是对农业生产而言。而生物炭的使用可以改善土壤碳固存和肥力。虽然生物炭已经广泛应用于土壤固存和肥力，但是关于生物炭和植物根系对细菌响应PAH胁迫的协同作用机制尚不清楚。本研究通过酶活性测定、高通量测序及土壤代谢组学结合分析生物炭和根际对细菌群落结构和功能的影响。结果表明，生物炭和植物根系提高了速效养分和可溶性有机碳的含量、酶活性，并改善了碳代谢功能。生物炭和植物根系的协同作用下，主要影响蔗糖和淀粉的代谢导致土壤代谢物多样性下降。在经过生物炭改良的土壤和根际土壤中，土壤性质、细菌成员和代谢物之间存在紧密的共生网络，这样有利于细菌抵抗PAH胁迫，从而去除PAH。基于以上结果，作者认为生物炭的施用可以有效改善根际土壤中的细菌功能。本研究结果促进了PAH污染土壤的原位修复程序的发展。
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实验设计
实验结果
1. 生物炭和植物根系调节PAH胁迫土壤的土壤性质和酶活性
图1 土壤酶活性在生物炭(BC)、根际圈(R)及其协同作用(BC-R)下的相对变化
柱子上的不同字母表示在LSD事后比较检验的p <0.05水平下，各处理之间存在显著差异。
2. 生物炭和植物根系调节PAH胁迫土壤中的细菌群落
与对照相比，生物炭和根际的共同作用可显著增加细菌丰富度及其多样性（图S3a），细菌群落结构由于生物炭和根际的作用而发生了变化（图S3b）。与对照相比，在用生物炭和植物根系联合处理时，前30种细菌门类中有30％的细菌门类的RA值显著增加，而13％细菌门类的RA值显著降低（p <0.01，图S3c）。与RA> 1％的细菌门相比，RA <1％的细菌门对生物炭和植物根系的响应程度更大（图S3c）。
LefSe分析反映了细菌分别对生物炭、根际以及生物炭和根际的共同影响的响应。生物炭和根际的共同作用导致变形菌门和酸杆菌门的相对丰度下降，以及其他细菌门的富集，例如，厚壁菌门，绿弯菌门，细菌拟杆菌门，放线菌门和疣微菌门（图2）。这表明生物炭和植物根系的存在有助于细菌群落的恢复。大多数细菌应答者之间是正相关的（图S6），表明在生物炭和植物根系的影响下，微生物组之间发生了较强的合作。微生物共生作用的增强也将有利于微生物对PAH的抵抗力。
对生物炭和/或根际的主要细菌应答者不同（图2）。在根际土壤中，特定微生物如绿弯菌门，细菌拟杆菌门和放线菌门的富集可以改善细菌活性和养分循环（图1和表S1）。PAH与根系分泌物的共代谢，以及根系分泌物导致的PAH生物利用度增加既可以减轻PAH对微生物的毒性，又可以提高PAH的去除效率。另外，生物炭的吸附会降低高毒性PAH的生物可及性并保护细菌生境。此外，通过生物炭和植物根系的联合作用而富集的特定细菌组分可以潜在地减轻对植物的污染胁迫。例如，许多PAH降解菌（如芽孢杆菌和分枝杆菌）的富集，有助于去除PAH并减少其对土壤微生物组的胁迫。
图2 在PAH胁迫的土壤中细菌群落成员对（a）生物炭效应、（b）根际效应和（c）生物炭和根际共同效应的响应
分支图的六个环表示域（最内），门，纲，目，科和属（最外）。
3. 生物炭和植物根系调节PAH胁迫土壤的细菌代谢功能
除了土壤细菌群落的变化以外，有必要进行细菌的代谢功能的分析以进行土壤质量改善的评估。不同处理之间的细菌功能有所不同，在生物炭和根际的共同作用下的变化最大（图S4）。PAH胁迫使大多数细菌代谢功能的RA值降低，而在用生物炭和根际处理时，RA值升高（图3a）。在根际土壤中施用生物炭可显著改善细菌功能（增加16.63％），包括异生物素的生物降解和代谢，这种改善支持了该处理中最大的PAH去除率（图S1）。同时，在根际土壤中添加生物炭后，与土壤碳代谢相关的细菌功能（例如脂质，碳水化合物和氨基酸代谢）也显著增加，其次是根际处理（图3a）。细菌代谢功能的增强将有利于形成更发达和健康的土壤生态系统，这可能是减轻PAH胁迫的一种方法。
图3 生物炭和根际对（a）预测细菌代谢功能的相对丰度、（b）不同代谢物变化的影响以及（c）基于不同代谢物的代谢途径的图解
柱子上的星号表示在LSD事后比较检验的p <0.05水平下，各处理之间存在显著差异。柱子旁边的值表示土壤代谢功能的相对变化。BC：PAH胁迫的土壤，含生物炭改良剂；R：PAH胁迫土壤的根际；BC-R：PAH胁迫的土壤的根际，含生物炭改良剂。
4. 生物炭和植物根系调节PAH胁迫土壤的微生物代谢
土壤代谢组学分析可以为生物炭和植物根系调节的PAH胁迫土壤中微生物群落和功能的变化提供证据。作者研究了对处理敏感并在不同处理之间有显著变化的差异代谢物。总共有19种差异代谢物对生物炭和/或根际有响应（VIP> 1和p <0.05；图3b）。PAH胁迫可显著降低某些代谢物的RA值，例如9-芴酮，安息香和对茴香酸，而通过生物炭和根际的共同作用可提高RA值（图3b）。此外，由于生物炭和根际的作用，2-酮丁酸和单硬脂酸甘油酯的RA值降低（图3b）。这可能归因于微生物对PAH胁迫的抵抗过程中氨基酸和脂质代谢的改善（图3a）。
土壤代谢物池的多样性在反映土壤功能和质量方面起着关键作用。作者观察到在生物炭和根际效应下土壤代谢物多样性降低，与土壤pH呈显著正相关，与CEC，DOC和NO3-的含量以及细菌的多样性和丰富度呈负相关（表S3）。对土壤理化性质的SWMR分析表明，土壤pH和NO3-含量是调节代谢物多样性的两个最重要因素（R2 = 0.723，p <0.01）（表S5），这与土壤pH和NO3-含量是影响土壤有机碳组成的最重要参数的发现是一致的。土壤代谢物是微生物的重要碳源。SWMR分析表明，代谢物多样性与细菌多样性呈显著负相关（R2 = 0.378，p <0.05）（表S4）。这表明高度多样化和丰富的细菌群落可以迅速消耗土壤碳源，减少中间产物的积累并降低土壤代谢物池的多样性。因此，土壤性质和细菌群落都可以调节土壤代谢池，反之亦然。
生物炭和植物根系对碳代谢的调节导致土壤代谢物的变化。土壤微生物组可以调整其代谢过程以应对环境胁迫，通过对这些差异代谢物的途径分析揭示了响应于生物炭和根际的代谢途径的改变（图3c）。淀粉和蔗糖的代谢以及各种氨基酸的代谢都受到了显著影响（图3c）。与对照相比，生物炭和植物根系的共同施用降低了淀粉和蔗糖代谢最重要的代谢产物之一葡萄糖-1-磷酸的含量（图3b），这可能归因于微生物代谢活性的显著上调（图1）和能量消耗的增加（图3a）。此外，氨基酸代谢的调节显示了氮素利用的微生物策略，这与脲酶活性的显著提高是一致的（图1）。与对照相比，结合施用生物炭和植物根系作用，土壤中N-氨甲酰谷氨酸的含量较低（图3b），这可能归因于缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成受到影响（图3b）。生物炭和根际对蔗糖和淀粉以及某些氨基酸的微生物代谢的影响可能是有利于土壤微生物抵抗PAH胁迫的机制，这也将通过调节土壤微生物代谢为指导生物刺激策略提供一定参考依据。
5. 生物炭和植物根系调节PAH胁迫土壤中土壤性质，细菌群落和代谢物之间的相互作用
生物炭和根际极大地改变了土壤性质（表S1）。通过它们的调节，土壤养分，DOC和SOM的含量显著影响土壤细菌群落（图S5a）和代谢物池（图S5b）。土壤性质的变化，包括养分有效性和SOM，可能会影响土壤微生物组对土壤代谢物的产生和消耗。土壤性质，细菌群落和代谢物之间的相互作用位于土壤碳循环的枢纽位置。由于细菌对生物炭，根际及其组合效应的响应不同（图2），因此作者认为土壤性质，细菌成员和代谢物之间的相互作用也随处理而变化。它们之间的共现网络显示出各种相互作用（图4）。
生物炭显著增加了NO3-的含量，降低了总氮（TN），SOM，AK和氨氮（NH4+）的含量（表S1），这些氮主要与代谢物如安息香，9-芴酮和葡萄糖-1p共同存在，并与细菌成员如拟杆菌门，嗜热油菌纲，Saccharimonadia，拟杆菌纲，Saccharimonadales，根瘤菌目和Ramillabaceter强烈共生（图4a）。拟杆菌门包含许多参与硝化作用的成员，导致NO3-含量增加。另外，Saccharimonadia，拟杆菌纲，Saccharimonadales和根瘤菌目可能对PAH胁迫具有抗性。在生物炭改良的土壤中，它们的富集与PAH降解产物（如安息香和9-芴酮）呈正相关，这也表明细菌在降解和解毒。同时，重要的能量指标之一葡萄糖-1p的含量降低，这可能归因于微生物代谢的消耗。
根际效应和如变形菌门，γ变形菌纲，拟杆菌纲，β-变形菌纲，亚硝化单胞菌科，嗜甲基菌科和伯克霍尔德氏菌科细菌成员的共同存在显著增加了NO3-的含量，并降低了土壤的pH值和TN，AK和TK的含量（表S1）（图4b）。邻苯二甲酸二辛酯是一种重要的根系分泌物，能响应并适应土壤环境的变化，是根际调节过程中主要的代谢物响应剂（图4b）。典型的硝化细菌亚硝化单胞菌科可能是导致根际土壤中NO3-含量显著增加的原因。另外，丰富的变形菌门，γ变形菌纲和β-变形菌纲也包括许多自养硝化细菌。硝化细菌可通过提高其对铵的亲和力并增强其对碳氢化合物污染物的抵抗力来加速受污染土壤中的硝化过程。
作者观察到了响应生物炭和根际共生效应的共现网络的最强密度（图4和表S6），表明相互作用最为复杂和紧密。在生物炭和植物根系的共同作用下，NO3-，AK和DOC的含量显著增加，而土壤pH值则显著降低（表S1），这主导了与特定细菌成员和代谢物共发生的土壤性状变化（图4c）。具体来说，主要细菌成员有厚壁菌门，绿弯菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，鞘脂单胞菌目，鞘脂单胞菌科，鞘氨醇单胞菌属和MND1（图4c）。葡萄糖-1p是最重要的代谢物，表明碳水化合物在该共现网络中的重要作用。厚壁菌门和绿弯菌门通常作用于土壤碳水化合物的水解，有助于PAH污染土壤的根际修复。此外，一般认为杆菌纲和芽孢杆菌目是土壤中重要的PAH降解菌。生物炭和植物根系的结合可以改善营养物质的利用，并改善某些降解菌（如绿弯菌门和MND1）的胁迫耐受性，有利于它们的生存。
图4 与对照相比响应（a）生物炭效应、（b）根际效应和（c）生物炭和根际协同效应，在土壤性质，土壤细菌分类群和土壤代谢物之间的共现分析
绿点代表土壤代谢物，橙色点代表土壤性质，蓝色点代表土壤细菌成员。SOM：土壤有机质；TN：总氮；TP：总磷；TK：总钾；AP：速效磷；AK：速效钾；DOC：溶解的有机碳；CEC：阳离子交换能力；NH4+：氨氮；NO3-：硝态氮。
6. 环境意义
农田土壤中新输入的PAH及其对土壤微生物的毒性导致研究细菌对PAH胁迫的响应至关重要。随着生物炭在农业土壤中的广泛应用，生物炭和植物根系对土壤微生物组的协同作用需要进行更深入的研究。生物炭和植物根系的结合不仅增强了微生物的代谢活性，调节了土壤细菌的群落结构，而且改善了PAH胁迫土壤的特异碳代谢。此外，细菌响应者之间的合作策略将有利于它们抵抗PAH胁迫并改善被污染土壤中的养分利用。不仅如此，当将生物炭应用于根际土壤时，还观察到土壤细菌成员，差异代谢物和土壤特性之间更紧密的共现网络，这突出表明了速效养分和能量资源对于细菌成员的生物降解和解毒的重要性。基于上述响应，值得注意的是，生物炭和植物根系的共同作用可以介导新鲜PAH对土壤细菌群落的胁迫，这种调节也有助于去除PAH。
结论
将生物炭和植物根系结合在一起可以增加PAH胁迫土壤中的微生物活性。此外，生物炭和根际增加了PAH胁迫抑制的细菌成员和功能。在生物炭和植物根系的共同作用下，碳水化合物代谢，尤其是蔗糖和淀粉的代谢受到影响。此外，在生物炭和植物根系的共同作用下，共现网络表现出了土壤性状、细菌成员和土壤代谢物之间更强的相互作用。土壤代谢物池的多样性主要受到土壤pH和NO3-含量（两个最重要的物理化学因素）以及土壤细菌多样性（最重要的微生物因素）的影响。细菌成员之间共生作用的增强有利于土壤微生物组对PAH胁迫的抵抗力，并有助于对受污染的土壤进行有效的生物修复。
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