编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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为了探讨微塑料纤维的肠道毒性，我们将斑马鱼幼体和成鱼暴露于不同长度的微塑料纤维(50±26μm和200±90 μm)下，发现生命早期的斑马鱼肠道中有微塑料纤维，它们引起肠道长度依赖性损伤，并表现为组织病理学改变和生物标志物反应，长微塑料纤维引起的影响更严重，与短微塑料纤维相比，它们显著减少了斑马鱼54% - 67%的食物摄取量。通过代谢组学研究我们进一步揭示了微塑料纤维在斑马鱼体内诱导的代谢变化，其中，短微塑料纤维和长微塑料纤维分别有124和123种代谢物发生显著变化。同时，在短纤维和长纤维处理组中共有41种变化显著的代谢物，于是我们进一步研究了纤维长度对毒性的影响。结果表明，微塑料纤维可上调甘油磷脂代谢，加重氧化损伤和炎症反应，下调与营养缺乏相关的脂酰基代谢。这些新发现加深了我们对微塑料纤维肠道毒性的理解，并证明代谢组学能够有力地阐明微塑料(MPs)毒性的潜在机制。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 微塑料纤维的特性
本研究中我们制备了不同长度的非荧光(图1A和E)和荧光(图1B和F)微塑料纤维(SFb和LFb)。SFb和LFb的直径均为20 μm，SFb和LFb的长度分别为50±26 μm和200±90 μm (图1C、G)，拉曼光谱证实了SFb和LFb的聚合物组成为PP(图1D和H)。如图S1所示，LFb的沉降速率比SFb快得多。
2. 肠道内微塑料纤维的摄取
显微镜和拉曼光谱分别证实了斑马鱼幼鱼和成鱼肠道中MPs的摄取情况。在7 dpf幼体的肠道中我们观察到SFb和LFb(图2A)，表明斑马鱼在生命的早期阶段就可以摄取长度分别为50 μm和200 μm的微塑料纤维。对于成鱼，SFb和LFb在肠道中均可被鉴定出来，我们也通过拉曼光谱确认了其聚合物类型(图2B)。结果表明，小肠是微塑料纤维暴露的重要靶组织。
3. 微塑料纤维引起的组织病理学损伤
通过组织病理学分析，我们揭示了微塑料纤维对斑马鱼幼鱼和成鱼肠道的损伤情况，其中，对照组无不良反应。在暴露于微塑料纤维的幼鱼(图3A)和成鱼(图3B)中，我们可以观察到明显的肠道损伤，在相同长度下，高浓度纤维比低浓度纤维引起更多的空泡化和物理损伤；在相同浓度下，长纤维比短纤维更容易引起空泡化和物理损伤。与对照组比较，微塑料纤维显著降低肠黏膜厚度27.78-59.71% (图3C)；与SFb-L相比，LFb-L可显著降低粘膜厚度38.27% (p < 0.05)；与对照组和SFb-H组相比，LFb-H组显著降低肠肌层厚度(p < 0.01)。
图3 微塑料纤维暴露引起的组织学损伤和食物摄入量变化
(A)不同种类幼鱼的典型肠道切片。(B)不同组别成人的典型肠道切片。(C)成人肠粘膜厚度。(D)成人肠肌层厚度。*表示治疗组与对照组比较差异有统计学意义(* p < 0.05， ** p < 0.01)。表示SFb组与LFb组间差异有统计学意义(# p < 0.05，## p < 0.01)。
4. 微塑料纤维引起的肠道毒性
然后我们分别用H2DCFDA(图4A)和中性红(图4B)染色评估幼鱼肠道的氧化应激和炎症情况。与对照相比，微塑料纤维的荧光强度提高了5.52 - 28.32%；相比之下，SFb-H、LFb-H增加了20.29%的ROS (p < 0.01)。与对照组相比，微塑料纤维增加了0.62 - 3.77%的炎症，与此同时，LFb-H比SFb-H诱导的炎症反应强4.46% (p < 0.01)。此外，我们用尼罗红染色来观察暴露于微塑料纤维后幼鱼的脂质含量，发现与对照组相比，各处理组的荧光强度均有所下降，说明暴露于微塑料纤维后，幼鱼体内脂质储存减少(图4C)，LFb-H组的脂质含量比SFb-H组低24.44% (p < 0.01)。这些结果表明，微塑料纤维在幼鱼肠道中引起氧化应激、炎症和脂质消耗，并呈长度依赖性。
我们还根据多种生物标记物评估了成鱼的肠道毒性，包括SOD、IL-1α和D-Lac。与对照组相比，SFb组和LFb组肠道SOD含量显著升高16.43 - 118.38%(图4D)；与SFb-H组相比，LFb-H组SOD含量显著增加87.55% (p < 0.05)；与SFb-L组比较，LFb-L组IL-1α水平显著升高54.55% (p < 0.05) (图4E)。另外，与对照组比较，所有治疗组中D-Lac显著降低(图4F)；而与SFb-L组比较，LFb-L组中D-Lac显著降低了51.96% (p < 0.05)。这些结果表明，微塑料纤维在成人肠道中对氧化应激、炎症和通透性产生了长度依赖性作用。
图4 微塑料纤维引起的肠道毒性
(A)用H2DCFDA染色评价幼鱼肠道氧化应激。(B)中性红染色评价幼鱼肠道炎症反应。(C)尼罗红染色法测定幼鱼肠道脂质含量。(D)成人肠道SOD活性。(E)成人肠道中IL-1蛋白水平。(F)成年人肠道中D-Lac的水平。*表示治疗组与对照组有显著性差异(* p < 0.05，** p < 0.01)。#表示SFb组与LFb组之间存在显著性差异(# p < 0.05，##p < 0.01)。
5. 微塑料纤维对食物摄入量的影响
我们检测了微塑料纤维对成年斑马鱼摄食的影响(图5)。与对照组相比，SFb-H在第3、5 min显著降低69.48% (p <0.05)和39.43% (p < 0.05)，而低脂饮食在第3、5、10 min显著降低69.48% (p < 0.05)，76.19% (p < 0.05)，76.06% (p < 0.05)，77.22% (p < 0.05)；与SFb-H相比，LFb-H分别在3、5、10 min显著降低摄取量54.54% (p < 0.05)、60.05 % (p < 0.05)、67.27% (p < 0.05)。结果表明，微塑料纤维抑制了成年斑马鱼的食物摄取量。
图5 接触微塑料纤维对成年斑马鱼摄食的影响
*表示治疗组与对照组比较差异有统计学意义(p < 0.05)。#表示SFb和LFb组比较差异有统计学意义(p < 0.05)。
6. 微塑料纤维引起的代谢改变
PLS-DA评分图显示，微塑料纤维显著影响肠道代谢产物的分布，LFb-H比SFb-H的影响更大(图6A)。与对照组相比，SFb-H和LFb-H分别产生124和123个SCMs(图S2)，这些代谢物的fold change见表S1。两组共有73个SCMs，这些代谢物被用于进一步的通路分析，其中，鞘磷脂代谢(p < 0.001)、甘油磷脂代谢(p < 0.05)和脂肪细胞因子信号通路(p < 0.05)是SFb-H和LFb-H触发的最相关通路(图S3)，所有这些途径都参与了脂质代谢，表明暴露于微塑料纤维的斑马鱼的脂质代谢被显著破坏。
为进一步研究纤维长度对毒性的影响，我们对SFb-H和LFb-H组之间的41个SCMs进行了识别(FDR < 0.01和VIP > 1)，并根据HMDB数据库进行注释(表S2)，有18个SCMs(43.9%)属于脂类和类脂分子(图S4)。此外，这些SCMs可进一步分为脂酰基(7个SCMs)、甘油磷脂(7个SCMs)、prenol脂质(2个SCMs)和类固醇及类固醇衍生物(2个SCMs)(图S5)；与SFb-H相比，LFb-H导致7个脂肪酰基显著减少，5个甘油磷脂显著增加(图6B)，这些代谢物在氧化应激、炎症和营养缺乏中发挥重要作用(图6C)。
图6 微塑料纤维引起的肠道代谢改变
(A) PLS-DA散点图显示各组间代谢变化规律。(B) SFb-H和LFb-H组之间代谢产物显著变化的热图。(C)拟制的SFb-H和LFb-H组代谢产物显著改变的代谢途径示意图。红色和蓝色箭头表示LFb-H组与SFb-H组相比代谢物增加或减少。
讨论
在本研究中，我们观察了暴露后幼鱼和成鱼肠道中的微塑料纤维。斑马鱼对塑料颗粒的吸收取决于颗粒的大小和鱼的发育阶段，除了一小部分小于10 μm的MPs可以被运输到贻贝的循环系统中，大多数MPs主要滞留在各种生物体的消化道中。此外，不同发育阶段的斑马鱼摄取MPs的方式也不同，胚胎可通过表皮接触多磺酸粘多糖，而成鱼或幼鱼可通过真皮、眼睛和口腔粘膜接触多磺酸粘多糖，其中，成鱼口服可能更明显，因为他们有更高的食物需求。但是目前的研究主要集中在塑料颗粒或碎片上，对于微塑料纤维在鱼类生命早期阶段的积累和分布情况我们尚不清楚。
微塑料纤维暴露引起肠的形态改变，包括肠黏膜和肌层厚度减少和异常空泡化，这些通常与营养缺乏和饮食改变有关，此外，暴露于微塑料纤维后，幼鱼体内脂质沉积的减少也表明其营养不良。除这些组织学证据外，代谢谱还揭示了微塑料纤维在分子水平上对肠道营养物质摄取和能量储存的影响，与SFb-H相比，LFb-H显著下调7种脂肪酸酰基代谢物，比如3-羟基十二酰肉碱、十二酰肉碱、16-羟基十六烷酸、9-oxoasimicinone、硬脂酸、16(17)-EpDPE和十六烯酸。脂肪酸酰基（包括许多脂肪酸）是重要的能源，在脂类组成中起着关键作用。3-羟基十二酰肉碱和十二酰肉碱是肉碱酰化产生的酰肉碱，可以反映CoA/酰基-CoA池的变化，因为酰基肉碱可以作为可用能量底物的指示物，其减少可能与低能量储备有关。而16-羟基十六酸和9- oxoasimicone主要来源于摄食源，硬脂酸属于lineolic acid (LA)，16(17)-EpDPE是由二十二碳六烯酸(DHA)环氧化而得，LA和DHA都是水生动物必需的脂肪酸，可以通过饮食获得。由于这些明显改变的代谢物大部分是通过饮食获得的，进一步说明营养缺乏与食物摄入有密切的关系。此外，在经过微塑料纤维处理的斑马鱼中，我们也证实了对食物摄取量的长度依赖性抑制，摄入的纤维可能会导致GIT阻塞，让鱼有饱腹感，从而减少摄食，实际上，摄入的纤维只能提供饱足感，而没有营养价值，会加剧身体的营养不足，此外，微塑料纤维处理组的氧化应激和炎症也可能引起脂质代谢紊乱，脂类易氧化。以往的研究表明，长期的氧化应激和炎症会损害脂质代谢；有报道称，暴露于多磺酸粘多糖后，斑马鱼的脂质代谢受损。
结论
总的来说，我们的研究结果表明，微塑料纤维可以被斑马鱼在不同的发育阶段，特别是在生命的早期阶段所吸收。微塑料纤维暴露会引起肠道的长时间依赖损伤和毒性，长纤维的影响更严重，微塑料纤维影响斑马鱼的潜在机制包括上调甘油磷脂代谢加剧氧化损伤和炎症，下调脂酰基代谢相关的营养缺乏。此外，本研究表明微塑料纤维的毒性值得深入研究，而代谢组学研究有助于揭示纤维效应的相关代谢毒性。
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