编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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多环芳烃（PAHs）是广泛存在的持久性环境污染物，它们在植物的不同发育阶段发挥毒性作用，而人们对植物应对多环芳烃的防御机制知之甚少，为此，转录组学和广泛靶向的代谢组学测序被用于研究菲胁迫下蒿柳中基因表达和代谢物的变化。基因和代谢物在治疗组和对照组之间存在显著差异，其中，13种氨基酸和参与其生物合成的关键基因在暴露于菲时被上调，半胱氨酸生物合成上调，而蔗糖、肌醇半乳糖苷和酒石酸是大量积累的主要碳水化合物；谷胱甘肽生物合成增强，以清除活性氧物种和解毒菲；硫甙和类黄酮生物合成上调；松柏素、芹菜素和没食子儿茶素的产量增加，这可能在抗氧化抗菲胁迫中发挥作用；此外，6种氨基酸和N，N'-（对香豆酰基）-肉桂酰基咖啡酰亚精胺的含量显著增加，这可能有助于保护植物免受菲胁迫，这些结果表明，蒿柳对菲的胁迫具有积极的防御策略，且随后的防御相关反应也可能发生在接触菲的24小时内。本研究结果将有助于阐明植物对多环芳烃胁迫反应的分子机制，并有助于指导作物和植物育种工作者提高多环芳烃抗性。
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实验设计
1. 首先利用转录组学分析菲暴露后蒿柳根中基因的表达水平，并对DEGs进行KEGG富集分析；
2. 然后利用代谢组学分析菲暴露后蒿柳根中的代谢物变化；
3. 最后将显著改变的代谢物与其相关基因和途径结合起来进行深入分析。
实验结果
1. 菲胁迫对蒿柳根系基因表达和代谢途径的影响
图1显示，菲暴露后，蒿柳根中许多基因的表达水平发生显著变化。在24小时的菲暴露中，分别有2163和2393个上调和下调基因；在36小时的菲暴露中，分别有2250和2615个上调和下调基因；在24-36小时的菲暴露期间，2176个基因的表达水平发生显著变化，1014个基因表达上调，1162个基因表达下调。
图1 菲暴露后的差异基因表达
CK:phenanthrenefree控制。F1: 24小时菲处理。F2:菲处理36h。
在拟南芥中，菲暴露8小时后诱导了许多参与胁迫反应调控的差异表达基因，有文献还报道了菲胁迫后24小时拟南芥防御相关蛋白表达的一个大峰值。在本篇文章中，36小时的菲暴露比24小时的菲暴露有更多的上调基因，因此，最大的基因诱导发生在24小时后菲暴露。与24小时相比，36小时暴露于菲时，上调与下调基因的比率较低，可能是因为24小时后菲的抑制作用增强。
我们对DEGs的KEGG富集分析确定了39条显著不同的代谢途径（Q<0.05；图2），有些通路的上调基因多于下调基因。在24小时的菲暴露中，这些途径有：半胱氨酸，蛋氨酸和酪氨酸代谢；氨基和核苷酸糖代谢；类黄酮生物合成；和异喹啉生物碱生物合成。在24小时和36小时的菲暴露中，这些途径有：硫代谢；谷胱甘肽生物合成；内质网和蛋白质加工；硫代葡萄糖苷生物合成；牛磺酸和次牛磺酸代谢；托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成，而对于其他显著不同的代谢途径，上调的基因比下调的少。
所有上调的代谢途径都与植物应对胁迫的防御反应有关。这一结果表明，植物在菲胁迫下能够通过调节基因表达来维持生存。虽然24小时暴露于菲的诱导基因比36小时暴露于菲的诱导基因少，但24小时暴露于菲的诱导代谢途径比36小时暴露于菲的诱导代谢途径更多。因此，蒿柳根对菲胁迫的防御反应最早可能发生在24小时内。
图2 CK与24、36小时菲处理间代谢途径差异显著（P<0.05）
2. 通过qPCR验证RNA测序
为了验证RNA测序表达数据，我们随机选择了来自不同代谢途径的19个基因进行qPCR（图3）。对于每个基因，转录组数据的表达谱与qPCR获得的相似，因此，我们的转录组测序数据是可靠的。
图3 差异表达基因的qRT-PCR验证
CK表达设为1，计算多个基因的相对表达水平。CYP81F3，CYP750A1，CYP78A4：氧化还原酶; CYP79A2：苯丙氨酸N-单加氧酶； CYP86A1：长链脂肪酸u-单加氧酶； CAD：肉桂基醇脱氢酶； RCS3：半胱氨酸合酶； HSP26-A：PARC谷胱甘肽S-转移酶； PCO1：半胱胺双加氧酶； P4H1：脯氨酰4-羟化酶； GH3.5：茉莉酸-氨基酸合成酶； SPS4：蔗糖-磷酸合酶； SUS3：蔗糖合酶； SAMDCS：腺苷甲硫氨酸脱羧酶； RBCS：核糖二磷酸羧化酶小链； RPI2：核糖5-磷酸异构酶A； AS1：多酚氧化酶； PAL：苯丙氨酸解氨酶； PARC：谷胱甘肽S-转移酶。
3. 菲胁迫下蒿柳根系代谢的变化
代谢组学在植物科学中具有重要的意义和价值。在本篇文章中，我们使用广泛的目标代谢测序在蒿柳根中检测到810种代谢物，根据VIP≥1和t检验P<0.05的标准，表1列出了显著不同的代谢物，代谢物的趋势如图4所示。其中，90种代谢物（75种上调，15种下调）在接触菲24小时后发生显著变化，在菲暴露36小时后，79种代谢物发生显著变化（55种上调，24种下调）。24小时后，主要是脂质下调；然而，在36小时后，脂质、氨基酸、核苷酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、类黄酮等均下调。结果表明，随着菲暴露量的增加，代谢产物的抑制作用增强，这一结论与转录组分析结果一致。
表1 菲胁迫下蒿柳根系代谢产物的变化
图4 由菲处理和CK的最显著不同代谢物的层次聚类产生的热图
代谢物水平的对数变化2倍用颜色编码；红色像素表示上调，蓝色像素表示下调。倍数变化基于峰强度。
4. 菲胁迫下蒿柳防御相关基因及代谢产物分析
我们将显著改变的代谢物与其相关基因和途径结合起来，得出结论：蒿柳的积极防御策略包括增强氨基酸合成、增加碳水化合物产量、加强谷胱甘肽生物合成、上调硫代葡萄糖苷生物合成和积累类黄酮和其他次生代谢物。
4.1 氨基酸合成
氨基酸和蛋白质是含氮有机化合物，是环境胁迫下氮、硫代谢的主要产物，这些生物分子也是糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环的中心，作为许多次级代谢物（如谷胱甘肽、生物碱和牛磺酸）的前体，这些化合物与逆境反应有关。在本篇文章中，13种氨基酸，包括天冬氨酸二-邻-葡萄糖苷、谷氨酸、谷氨酸、L-色氨酸、L-(—)-酪氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、脯氨酸、L-缬氨酸、L-瓜氨酸、L-丙氨酸和D-(+)-苯丙氨酸，在菲胁迫下24小时和36小时都被发现显著激活，某些关键基因显著上调（图5）。
半胱氨酸（Cys）是硫同化的最终产物，分两步合成：首先是通过丝氨酸乙酰转移酶（SAT）将丝氨酸转化为O-乙酰丝氨酸（OAS）；然后，转化为以硫化氢（H2S）和OAS形式存在的还原硫。
Cys通过O-乙酰丝氨酸（巯基）裂解酶（OAS-TL）。在本篇文章中，丝氨酸乙醛酸转氨酶（AGT1）和甘氨酸羟甲基转移酶（SHM1）的下调降低了丝氨酸的合成；然而，丝氨酸乙酰转移酶（SAT3和SAT1）在24小时和36小时菲暴露时均上调，并增强丝氨酸向半胱氨酸的转化。硫代谢通过硫双加氧酶（GLY3）和亚硫酸盐还原酶（SIR1）显著上调，半胱氨酸合成酶（CYS1和RCS3）也明显上调（图5），因此，加强硫化物和丝氨酸转化能够增加半胱氨酸的合成。半胱氨酸是一种强大的抗氧化剂，它通过减轻氧化损伤、促进硝酸盐吸收和/或叶片运输而影响植物生长，此外，半胱氨酸是某些次生植物代谢物的前体，如谷胱甘肽和牛磺酸。
谷氨酸是氨合成谷氨酰胺的底物，谷氨酸的碳骨架和α-氨基构成了合成γ-氨基丁酸、精氨酸和脯氨酸的基础。在这项研究中，24小时和36小时菲治疗组的谷氨酸和谷氨酸水平显著高于对照组；谷氨酸脱氢酶（GDH2）在菲作用24h后表达上调，可能是由于植物在逆境下产生的活性氧（ROS）能激活蛋白酶，诱导细胞产生过量的铵，而多余的NH4þ通过转氨作用转化为谷氨酸和谷氨酰胺，或通过谷氨酸脱氢酶转化为进入TCA循环的α-酮戊二酸。
缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸来自糖酵解副产物丙酮酸。在本研究中，与对照组相比，暴露于24小时和36小时菲的L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸均显著增加；产物3-异丙基苹果酸（IIL1）和支链氨基酸转氨酶（BCAT2）在24小时菲暴露时上调；亮氨酸和缬氨酸在产氰糖苷的生物合成中起着关键作用，它们可以保护植物免受食草动物和病原菌的伤害。
酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸是来源于莽草酸途径的芳香族氨基酸，它们被用于蛋白质的合成，在植物中，它们也是许多天然产物的前体，如生物碱、激素和细胞壁成分。在本篇文章中，L-色氨酸、L-(—)-酪氨酸和D-(+)-苯丙氨酸在24小时和36小时菲暴露时显著上调；酪氨酸转氨酶（TAT1和TAT）和支链氨基酸转氨酶（BCAT2）在24小时菲暴露时上调，酪氨酸首先转化为4-羟基苯丙酮酸，因此，4-羟基苯丙酮酸双加氧酶将后者转化为都灵酸，其中，都灵酸是生育酚的前体，如维生素E和塑性醌，提高植物的抗逆性。色氨酸是许多次级代谢物的前体，如生长素、抗毒素、硫代葡萄糖苷和生物碱，它们可以增强芳香化合物的生物合成，而苯丙氨酸参与苯丙酸途径中几种植物化学物质和抗氧化剂的生物合成。
脯氨酸是细胞壁蛋白形成和渗透调节的重要组成部分，它由谷氨酸经谷氨酸脱氢酶和δ-1-吡咯啉5-羧酸合成酶（P5CS）合成，其中，P5CS是谷氨酸脯氨酸合成途径中的关键酶。在本研究中，谷氨酸脱氢酶（GDH2）、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和脯氨酰4-羟化酶（P4H1）上调；此外，谷氨酸、L-脯氨酸和脯氨酸水平在24小时和36小时菲暴露时显著高于对照组。
我们所观察到的氨基酸生物合成的增加为应激相关代谢物提供了必要的前体，其中一些还充当渗透调节、蛋白质合成和植物抵抗胁迫所需的能量燃料。
图5 氨基酸代谢的简化表示法
红色、蓝色和白色矩形框分别代表代谢产物的增加、减少和无明显变化。红色基因被上调。红色长方形代表上调的代谢途径。白色长方形代表没有明显改变的代谢途径。
4.2 糖类合成
植物对不利环境条件的适应需要大量的代谢能。以往有研究报道了垂桦、云杉、樟子松和山杨次生韧皮部棉子糖的渗透保护和抗氧化性能，肌醇半乳糖苷是一种常见的植物棉子糖和半乳糖苷供体。研究表明，肌醇是在盐胁迫下产生的，海藻糖是在缺氧条件下形成的。在水分胁迫和盐胁迫下，蔗糖、果糖和葡萄糖的含量会急剧增加，蜜二糖是由半乳糖和葡萄糖之间的α-1,6键形成的二糖。
与对照样品相比，受24小时和36小时菲作用的植物表现出显著的蔗糖、肌醇半乳糖苷和蜜二糖积累（图6），蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）是高等植物蔗糖代谢的关键酶。在本研究中，蔗糖合成酶（SUS3）、磷酸蔗糖合成酶（SPS4）和蔗糖转运蛋白（SWEET16和SUC2）在24小时和36小时菲暴露时均显著上调；此外，α-海藻糖酶（TRE1）、糖原磷酸化酶（PHS2）、4-糖苷转移酶（DPE2）、水苏糖合成酶（STS1）和棉子糖合成酶（RFS2）在24小时和36小时菲暴露时相对上调；β-呋喃果糖苷酶（INV1）和α-葡萄糖苷酶（Os06g0675700）在24小时菲暴露时上调。研究表明，多环芳烃通过渗透细胞膜，促进细胞和组织的氧化应激，降低植物水分和养分的利用效率，因此，一些糖和相关基因的上调可能是对菲胁迫下渗透调节和高能量需求的响应。
图6 菲胁迫下半乳糖代谢
红色基因和代谢物被上调。
4.3 谷胱甘肽合成
在植物中，外源解毒分三个阶段进行，细胞色素P450通常是第一解毒酶，而谷胱甘肽途径是第二阶段。谷胱甘肽途径的主要功能是催化具有高电子亲和力的环氧化物和谷胱甘肽结合产生谷胱甘肽结合物，阻止多环芳烃环氧化物与DNA结合，因此，谷胱甘肽在多环芳烃代谢中起着重要的解毒作用。谷胱甘肽也是一种关键的水溶性抗氧化剂，参与活性氧清除，其生物合成取决于半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸的可用性。g-谷氨酰半胱氨酸（g-EC）由谷氨酸和半胱氨酸在谷氨酸-半胱氨酸连接酶（g-谷氨酰半胱氨酸合成酶；g-GCS或GSH1）催化的ATP依赖反应中形成，因此，g-EC与甘氨酸结合并生成谷胱甘肽。谷胱甘肽还原酶（GR）回收谷胱甘肽。在本研究中，与对照组相比，谷氨酸半胱氨酸连接酶（GSH1）和谷胱甘肽还原酶（GR1）在暴露于24小时和36小时菲后显著上调，此外，谷胱甘肽含量相对增加，在24小时菲暴露。这些观察结果表明谷胱甘肽的合成增强，并且谷胱甘肽产物参与了对菲胁迫的抗氧化反应。谷胱甘肽-S-转移酶（GST）通过用谷胱甘肽取代亲电基团来解毒几种外源物质，如除草剂。GST在解毒甲基胆蒽活性代谢物中起主要作用，它通过介导催化GSH结合和随后的排出形成高度可溶性的解毒复合物。麻疯树根系与芘降解菌铜绿假单胞菌（PDB1）的GSH和GST的联合作用能有效降低PAH诱导的根际胁迫。与对照组相比，编码GST的基因，包括HSP26-A、PRP1、Mgst3、GSTU7、GSTU8和PARC，在24小时和36小时菲暴露时显著上调。在菲胁迫下，GST活性和GSH的产生都得到了提高，从而达到解毒的目的。
4.4 增强其他抵抗途径
多环芳烃暴露可引起植物的致病和抗性反应。有文献报道了在暴露于菲的拟南芥中形成坏死损伤，并且致病相关蛋白PR1上调。对差异表达基因和代谢物的分析表明，在菲胁迫下，与抗病性相关的硫甙和黄酮类化合物的合成上调。
4.4.1 芥子油苷生物合成
芥子油苷是芸薹科植物的重要代谢产物，具有抗癌和抗菌的作用。某些硫代葡萄糖苷参与植物防御，而另一些则是有效的食草动物威慑。硫代葡萄糖苷由脂肪族、芳香族和吲哚硫代葡萄糖苷组成。硫甙生物合成的三个阶段包括氨基酸转化为醛肟和侧链延伸、核心硫甙结构形成和侧链修饰：第一阶段是芥子油苷生物合成的关键步骤，在植物中由细胞色素P450酶催化，CYP79A2将苯丙氨酸转化为苯乙醛肟，苯乙醛肟是苄基硫代葡萄糖苷的前体；下一步，CYP83A1和CYP83B1分别氧化脂肪族醛肟和芳香族醛肟。C-S裂解酶SUR1、葡萄糖基转移酶UGT74B1和UGT74C1在硫甙生物合成中起着关键作用，在本篇文章中，苯丙氨酸和酪氨酸水平显著增加；同时，苯丙氨酸单加氧酶（CYP79A2，CYP83B1）和葡萄糖基转移酶（UGT74B1）在24小时的菲暴露下上调，因此，在菲胁迫下，芳香族硫代葡萄糖苷的生物合成增强，可能促进蒿柳对病原菌的抗性。
4.4.2 类黄酮生物合成
植物中含有丰富的类黄酮。这些次生代谢产物具有生物活性和生物化学多样性，包括花青素、黄酮醇、黄酮、黄酮酮、查尔酮、二氢查尔酮和二氢黄酮醇，类黄酮能使植物耐受富含有毒金属的土壤，如铝。与野生型（WT）相比，透明种皮（tt4）突变体缺乏查尔酮合酶活性，在拟南芥中表现出一致的生长素运输和表型生长变化。在本研究中，柚皮素3-双加氧酶（AN3）、黄烷酮4-还原酶（DFR）和白细胞花青素还原酶（LAR）在36小时时显著上调（图7），同时，松柏素含量是未处理组（对照组）的64.77倍。柚皮苷转化为芹菜素，芹菜素的含量是对照的2.85倍。匹诺西布林能中和活性氧（ROS），减轻炎症，芹菜素在人体内具有抗氧化和抗癌作用，因此，松柏素和芹菜素对菲胁迫下的植物具有活性氧猝灭作用，而我们观察到的布丁和二氢槲皮素的减少归因于AN3和DFR介导的转化率增加。表没食子儿茶素是二氢槲皮素的下游产物，其水平在24小时菲治疗组高于对照组。表没食子儿茶素在人体内发挥抗氧化和抗炎作用。鉴于此，这里观察到的增加可能是植物对菲胁迫的抗氧化反应。
此外，在24小时的菲处理中，金圣草黄素也增加，这可能通过抑制BPDE-DNA加合物的形成，通过调节苯并[a]芘（BaP）在人体内刺激的芳香烃受体途径，参与BaP等环境致癌物的化学预防。因此，金圣草黄素的升高可能是蒿柳抵御菲胁迫的防御策略。
图7 菲胁迫下类黄酮的生物合成
红色基因和代谢物被上调。绿色代谢物被下调。
4.5 其他次生代谢产物
有机酸在植物细胞和组织中维持电荷平衡和稳定的pH值。在水分胁迫和重金属胁迫下，植物体内有机酸含量增加。在本研究中，与对照组相比，菲处理24小时后，六种有机酸的含量都有所增加，包括戊二酸、6-氨基己酸、甲基丙二酸、氨基丙二酸、琥珀酸和香兰素，这可能与蒿柳根系适应菲胁迫的电荷平衡和稳定pH值有关。
哌啶和1,4-二氢-1-甲基-4-氧代-3-吡啶甲酰胺的生物碱在24小时和36小时菲暴露时均显著增加。苯酚N，N'-（对香豆酰）-肉桂酰咖啡酰亚精胺也在24小时和36小时菲暴露时显著增加，而精胺能使植物经受高温和镉胁迫。因此，我们观察到N，N'-（对香豆酰）-肉桂酰咖啡酰亚精胺的增加可能是对菲暴露的特异性保护反应。
脂质是重要的生理活性物质和信号分子，这些生物分子参与细胞代谢和能量储存，稳定细胞骨架，某些研究报道脂类调节盐胁迫。在这项研究中，与对照组相比，6种脂质在24小时的菲暴露下显著增加。它们包括13-羟基-9，11-十八碳二烯酸（13-HPODE），9-羟基-（10E，12Z，15Z）-十八碳三烯酸，14,15-脱氢丙酸，棕榈醛，十八碳-11E，13E，15Z-三烯酸和α-亚麻酸。13-HPODE是一种内源性脂质过氧化物，9-羟基-（10E，12Z，15Z）-十八碳烯酸是α-亚麻酸的一种产物。因此，膜脂过氧化可能是菲胁迫引起的。A-亚麻酸含量的活性增加可能对植物有益，因为这种脂肪酸是长链n-3多不饱和脂肪酸的前体，如二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。
结论
本研究首次将转录组学和代谢组学结合起来研究蒿柳对PAH中毒的防御机制。与对照相比，菲暴露24h后蒿柳根系的基因表达和代谢产物发生了显著的变化。在菲胁迫下，蒿柳具有积极的防御策略，13种氨基酸显著增加，半胱氨酸代谢显著增强，成为植物抗逆性所需的胁迫相关代谢物、渗透调节和能量燃料的必要前体。蔗糖、肌醇半乳糖苷和蜜二糖是植物对菲胁迫产生高能量的主要碳水化合物；谷胱甘肽生物合成增强，以使活性氧清除和菲解毒；硫苷生成和类黄酮生物合成的上调与抗氧化剂和病原菌抗性密切相关。菲暴露后，6种有机酸和N，N'-(pcoumaroyl)-肉桂酰咖啡酰亚精胺表达上调，可能参与了菲胁迫的保护/防御反应。
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