科研 | Nat. Commun.：高脂饮食诱发的外泌体卵磷脂与胰岛素抗性有关

编译：微科盟向阳而生，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

高脂饮食（HFD）可降低胰岛素的敏感性，但高脂饮食怎样导致胰岛素抗性在很大程度上未知。本篇文章中，我们发现从饲喂HFD的肥胖小鼠或者患II型糖尿病病人的粪便中分离出的外泌体后，注射瘦型小鼠，该小鼠表现出胰岛素抗性。HFD改变了来自瘦型动物（L-Exo）和来自肥胖动物（H-Exo）外泌体中的磷脂酰乙醇胺（PE）脂类和卵磷脂（PC）的组成。我们发现肠道中的H-Exo可被肝细胞和巨噬细胞所吞噬，导致胰岛素信号通路的抑制。另外，外泌体来源的PC可结合并激活AhR，导致胰岛素信号转导通路关键基因表达激活的抑制，比如IRS-2，及其下游基因PIK13和Akt。总之，我们的结果显示HFD-诱导的外泌体可作为抑制胰岛素的潜在作用分子，因此，肠道外泌体具有作为治疗性靶标的广阔研究前景。

论文ID

原名：High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance

译名：高脂饮食诱发的外泌体卵磷脂与胰岛素抗性有关

期刊：Nature Communications

IF：12.121

发表时间：2021.01

通讯作者：Yun Teng , Huang-Ge Zhang

通讯作者单位：美国路易斯维尔大学微生物与免疫学系

实验设计

实验结果

1.HFD改变了小肠上皮细胞CD63⁺A33⁺的外泌体组成

为了研究HFD对于肠道上皮所释放的外泌体的效应，我们采用了一个12月龄的HFD诱导的肥胖小鼠模型（补充图1a），这个模型模拟了患胰岛素抗性的人类肥胖症。与饲喂常规食糜（RCD）12个月的小鼠相比，HFD小鼠表现出葡萄糖不耐受（补充图1b）以及胰岛素抗性（补充图1c）的特征，这种HFD小鼠表现为肥胖，体重增加以及附睾白色脂肪组织重量（WAT）增加（补充图1d，e），血浆和肝脏甘油三酯中白色脂肪组织重量增加（补充图1f，g），脂肪肝和脂肪组织变性（补充图1h，i）。我们从HFD饲喂的小鼠肝脏（补充图1j）和肠组织提取物（补充图1k）中观察到炎性细胞因子上升，HFD小鼠中PC和酰肉碱含量也增加了，神经酰胺（补充图1l）表达未发生变化的小肠组织脂类表达谱也发生了改变。

我们通过差速离心将外泌体从一组12月龄大、HFD饲喂小鼠（H-Exo）以及另一组年龄和性别与之相匹配的RCD小鼠（L-Exo）粪便中分离出来，又通过重定向电子显微镜对来自RCD和HFD小鼠中经蔗糖纯化的外泌体（补充图2a）（补充图2b）进行了特征的鉴定，再通过纳米追踪分析检查外泌体的大小，发现L-Exo和H-Exo颗粒大小分别为115 ± 52nm和120 ± 54nm（补充图2c）。我们采用Western blot方法（补充图2d）评估出L-Exo和H-Exo外泌体对于CD63，CD81，CD9，MHCII和A33为阳性（小肠上皮细胞标记），而CD63和A33的双阳性则通过共聚焦显微镜进行评估（补充图2e）。质谱（MS）/MS分析表明在通过CD63⁺A33⁺抗体对粪便外泌体进行pulldown后，检测不出任何细菌来源的蛋白或细菌外泌体蛋白（补充表1）。我们在琼脂糖胶中跑CD63⁺A33⁺和CD63^-的EVs中也无法观察到16S或18SRNA条带（补充图2f），而qPCR分析进一步表明在CD63⁺A33⁺外泌体中无法扩增出细菌的16S条带，在CD63^-EVs中无法扩增得到miR375（在宿主外泌体中被胶囊包裹，但在微生物EVs中不能被包裹）（补充图2g，h）。无论在CD63⁺A33⁺的L-Exo或者H-Exo的外泌体中，我们都无法检测到细菌EVs组分之一的LPS（磷脂多糖）（补充图2i）。总之，这些包括蛋白质MS/MS谱，16S和18SRNA谱，以及LPS脂类在内的结果证实了此研究中使用的外泌体并非细菌来源的产物。从HFD小鼠中被分离出来（~5 × 10¹⁰纳米颗粒/g粪便）的纳米颗粒绝对数量相比RCD小鼠（补充图2k）显著较高，表明从肠道上皮细胞中释放出的外泌体受到HFD的影响。

接着我们评估了HFD是否影响了CD63⁺A33⁺外泌体的组成。在观察到蛋白质的改变（补充表1）和miRNA表达的改变后（补充图2l和补充表2），我们发现外泌体脂质谱受HFD的影响最为严重（图1和补充表3）。我们对总脂类的四级串联质谱分析表明L-Exo（饲喂RCD后6个月进行收集）在PE中的富集程度为56.8%，而H-Exo（HFD饲喂后6个月）在PC中的富集程度为22.9%（图1a）。我们采用四级串联质谱测定获得PE和PC在L-Exo中的浓度分别为86.3 ± 1.76和2.0 ± 0.05nmol，而在H-Exo中，PE和PC的浓度分别为13.4 ± 1.68和34.1 ± 1.19nmol。而在HFD被饲喂后12个月，H-Exo中PC脂质的百分比显著的下降了38.8%，PE从10.6%下降到1.3%（图1c）。虽然在L-Exo中PE和PC的浓度分别为101.0 ± 2.40和3.01 ± 0.06nmol，但是，在H-Exo中，PE和PC的浓度分别为9.6 ± 1.2以及256 ± 2.9nmol（这是通过采用四级串联质谱测定的结果）（图1d）。多重相关因子分析表明PC是受到感染最多的脂类。与饲喂RCD12个月的小鼠相比（1.9%，补充图1l），上述结果也受到饲喂HFD12个月的小鼠（3.6%）肠道组织中PC脂类的比例增加的试验数据支持。相比在饲喂6个月时，L-Exo脂类的组成在RCD饲喂12个月时没有显著的改变。来自肠道组织的荧光激活的细胞分选（FACs）四级串联质谱分析-分类的A33⁺细胞表明HFD小鼠比瘦型小鼠具有较高的PC含量（补充图3a和补充数据1）。总之，这些数据表明更多位于肠道上皮细胞中的PC导致了粪便中CD63⁺A33⁺外泌体的较高水平。接着，我们确定了饲喂HFD小鼠血液循环中分离出的外泌体是否同样具有较高的PC浓度（补充图3b和补充数据1）。粪便中外泌体PC浓度从0.6%到38.8%的急剧升高（RCD相对于HFD饲喂方式），而相比血浆中从16.15%升高到43.0%的外泌体PC，我们认为与血液中外泌体相比，只有较少的组织参与了外泌体释放进入肠道的过程。本研究的初衷是解剖出PC在胰岛素响应中的作用，而考虑到粪便中外泌体的PC的急剧升高，我们在整个研究中采用了粪便外泌体。

图1 高脂肪饮食（HFD）改变了肠道上皮细胞释放的外泌体的脂类组成

（a-b） 饲喂正常饮食（RCD）和高脂饮食（HFD）6个月（n = 10只/组）小鼠肠道上皮细胞分泌出的粪便外泌体（CD63⁺A33⁺）中脂类被提取。饼图代表每种脂类物质的比例，采用四级串联质谱进行确定（a）。PE和PC浓度（nmol）在右侧栏目中显示（b）。涂色的三角形-L-Exo以及涂色的长方形-H-Exo。（c-d） 经历12个月的分别饲喂后（n = 10只/组）通过四级串联质谱的从小鼠粪便外泌体中收集到的脂类物质。饼图代表每种脂类的比例（c）。PE和PC浓度（nmols）在右侧栏目中显示（d）。（e-f）饼图（e）代表来自健康（健康-Exo，n = 5）和患II型糖尿病（T2D-Exo，n = 7）个体粪便外泌体（CD63⁺A33⁺）的脂类亚型。通过四级串联质谱确定的PE和PC浓度（nmols）在右侧栏目中显示（f）。空心三角形—健康-Exo和空心长方形—T2D-Exo。

接下来我们采用高效液态色谱（HPLC）分析了当RCD和HFD小鼠在3,6，和12月龄饲喂其对应日粮时它们的CD63⁺A33⁺水平，并确定了外泌体PE和PC水平的动态变化。与四级串联质谱分析一致，HPLC分析同样确定了与L-Exo相比，H-Exo包含了PC水平的增加（在6月龄和12月龄时分别为~40μm和80μm）。

接着我们发现氟他替乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）（一种可将PE转化为PC的转移酶），在饲喂HFD小鼠的肠组织和肝脏组织中比RCD对照组小鼠的含量更高。Western blot分析表明在3,6和12月龄饲喂其对应日粮时，相比RCD小鼠，PEMT水平在HFD小鼠肠道组织和肝脏组织中水平上升（补充图3d，e）。另外，来自HFD小鼠结肠上皮（MC38）细胞的代谢产物显示荧光素酶基因表达上升并受到PEMT启动子的驱动（补充图3f），表明编码PEMT的基因受到HFD的调节。

2.小肠上皮细胞CD63⁺A33⁺外泌体的组成在胰岛素抗性的II型糖尿病患者中发生改变

为了确定这些来自肥胖小鼠的研究发现是否可被用于胰岛素抗性的II型糖尿病，我们对从患II型糖尿病的胰岛素抗性患者（T2D）和健康对象的粪便样本中分离出的外泌体的特征进行了鉴定。来自健康对象（Healthy-Exo）和来自II型糖尿病人（T2D-Exo）的外泌体大小范围分别为104 ± 81nm和190 ± 86nm（补充图4a）。和小鼠的外泌体一样，这些来自人类的外泌的CD63，CD9，CD81为阳性（外泌体标记），我们又对A33（补充图4b，c）以及无16S细菌rDNA进行检测（补充图4d），如小鼠的外泌体，这些人类来源的外泌体的CD63，CD9，CD81（外泌体标记）为阳性，并且未检测出细菌的16S rDNA（补充图4d）。相比健康人（~2 × 10¹³，补充图4e），我们发现在患糖尿病病人的粪便样本中的总外泌体数量显著较高（~4.5 × 10¹³纳米粒/g粪便），也发现T2D病人CD63⁺A33⁺双阳性外泌体的绝对值显著高于健康人（补充图4f）。接着，我们对来自健康和T2D病人粪便外泌体样本中的PE和PC采用四级串联质谱进行分析。正如来自小鼠外泌体的分析结果，相比健康人（~0.35%，图1e，补充表3），T2D病人的外泌体也携带了较高水平的PC （~10%）。PE和PC的浓度在健康人外泌体中为31.3 ± 0.95和0.33 ± 0.03nmol，而在T2D的外泌体中，PE和PC的浓度分别为67.5 ± 1.96和10.6 ± 0.60nmol，这是我们采用四级串联质谱进行测定的（图1f）。与四级串联质谱分析，HPLC定量分析也显示出在T2D外泌体中（补充图4g，h）较高水平的PC（~22μM），而在健康患者的外泌体中，PC无法被检测出。异常高和低的PC/PE比例在T2D外泌体中比健康人的外泌体中显著较高（补充图4i）。相似的结果也可从小鼠外泌体和小肠组织中获得（补充图4j，k）。

3.H-Exo和T2D-Exo作用于胰岛素抗性和葡萄糖不耐受症的发展

我们接着研究了H-Exo改变的脂质谱在响应葡萄糖和胰岛素敏感性方面是否发挥作用。为了评估H-Exo的体外效应，我们连续14天，每天给予瘦型小鼠CD63⁺A33⁺L-Exo或者H-Exo（2 × 10⁹/剂溶于200μL含有3,5,10或14剂PBS的溶液中），同时饲喂HFD。在14天的处理期内，H-Exo（任何剂量）对于小鼠的体重无任何效应（补充图5a），但是10剂量的H-Exo可导致在胰岛素敏感性小鼠中剂量依赖性损伤（补充图5b，10剂量栏目）。14剂量的H-Exo可导致进一步的胰岛素敏感性的损伤，因为小鼠在胰岛素注射后的所有时间点中都表现出对胰岛素的抗性（补充图5b；14剂量栏目）。基于此结果，14剂量（1剂量/日）的L-Exo或者H-Exo在整个研究中被给予所有的小鼠。葡萄糖耐受（GTT）和胰岛素耐受检测（ITT）表明H-Exo受体小鼠表现出葡萄糖的不耐受并显示出胰岛素抗性的影响（图2a）。

综合性的实验动物监测系统（CLAMS，代谢笼）分析表明与PBS和L-Exo受体小鼠相比（补充图5c-i），H-Exo注射对于受体小鼠的身体组成（体重，脂肪，和瘦肉量），能量消耗，耗氧量，CO₂产生，呼吸交换速率，运动能力，步行活动无任何效应。相比PBS和L-Exo受体小鼠，H-Exo受体小鼠表现出较少的食物摄入（补充图5j）。

高胰岛素血症血糖钳分析表明：与80-120min时血糖钳分析的小鼠相比，接受L-Exo注射的小鼠比接受H-Exo注射14天的小鼠表现出显著较低的葡萄糖输注率（GIR）（图2b）；另外，在不同试验组之间，我们观察到了胰岛素水平的显著差异，但是并非在血糖钳分析的时间点上（图2d；在GTT过程中针对胰岛素浓度的补充数据2）。我们观察到内源性的肝脏葡萄糖产生在血糖钳分析过程中显著较高。在此分析过程中，H-Exo受体小鼠与PBS和L-Exo受体小鼠相比表现出百分比的显著下降的情况（图2e，f）。全身的葡萄糖分解在H-Exo受体小鼠中表现出显著的抑制（图2g）。个体组织的葡萄糖摄入数据表明H-Exo受体小鼠的棕色脂肪，WAT，以及骨骼肌（腓肠肌）组织相比PBS或者L-Exo受体小鼠对葡萄糖的摄入显著降低（图2h）。血浆中自由脂肪酸（FFA）在基础水平（在血糖钳之前，-10min）并未观察到变化，但是在120min时，这些指标在H-Exo受体小鼠血浆中显著升高。总之，这些结果表明H-Exo导致了小鼠的血糖不耐受和胰岛素抗性。

接着，我们确定了来自T2D病人粪便中CD63⁺A33⁺T2D-Exo可能会诱发C57BL/6SPF小鼠中葡萄糖的不耐受和胰岛素抗性。小鼠采用灌胃，给予人类CD63⁺A33⁺（健康外泌体或者T2D外泌体）外泌体14天，同时饲喂HFD日粮。T2D-Exo在14天的处理期内对于小鼠的体重无效应（补充图5k），而该效应不如在经过H-Exo处理后表现的强烈，GIT和ITT的结果表明接受T2D-Exo处理的小鼠表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抗性（图2j）。

为了确定H-Exo对于胰岛素响应的有害效应是否依赖于肠道微生物组，我们让与年龄匹配的无菌的C57BL/6雄性小鼠口服H-Exo或L-Exo，并且口服健康外泌体或者T2D外泌体14天，同时服用HFD。令人惊讶的是，H-Exo处理导致了SPF和无菌小鼠表现出葡萄糖耐受性并降低其对于葡萄糖的响应。这些结果表明H-Exo和T2D-Exo对于独立于肠道微生物组的胰岛素响应具有负效应。为了检测出H-Exo的生理病理学效应是否能够以肠道微生物菌群依赖的方式进行改变，我们对通过HFD饲喂的12月龄小鼠采用/不采用抗生素饲喂7天然后从抗生素处理的小鼠中分离出H-Exo（H-Exo12Mab⁺和H-Exo12Mab^-）并且通过对无菌小鼠进行灌肠检测胰岛素的响应。在两组无菌H-Exo受体小鼠中我们未观察到葡萄糖不耐受和胰岛素抗性之间的显著差异（图2l），表明这种由于抗生素处理导致的细菌组成的变化与PBS处理的小鼠相比，似乎不能改变H-Exo诱导葡萄糖不耐受和胰岛素抗性的功能。  

图2 来自HFD小鼠的CD63⁺A33⁺外泌体在饲喂HFD的小鼠中诱导胰岛素抗性

(a) 针对C57BL/6小鼠（n = 10）在接受过继转移小鼠CD63⁺A33⁺粪便外泌体14天同时饲喂HFD日粮时葡萄糖（GTT）和胰岛素抗性检测（ITT）。实心圆圈—PBS，实心三角—L-Exo，实心长方形—H-Exo。(b) 在葡萄糖钳分析中葡萄糖灌注速率（GIR）（n = 4/组）。(c) 在葡萄糖钳分析中血液葡萄糖水平（n = 4/组）。(d) 血浆胰岛素的基础水平（—10min）和在葡萄糖钳分析过程中的水平（120min）。(e-f) 肝脏葡萄糖产生以及肝脏葡萄糖产生的百分率下降（n = 4/组）。(g) 通过葡萄糖钳分析确定的全身葡萄糖分解速率（n = 4/组）。(h) 葡萄糖通过棕色脂肪（BAT），白色脂肪组织（WAT），以及经过血糖钳分析后的肌肉组织的摄入量（n = 4/组）。(i) 血浆游离脂肪酸的基础含量和在葡萄糖钳分析过程中的水平（n = 4/组）。(j-m)针对C57BL/6或者经人类外泌体过继转移的C57BL/6无菌小鼠GTT（上栏）和ITT（下栏）（j）, 小鼠和人的外泌体（k）, 经过抗生素处理和不经抗生素处理的小鼠的外泌体（l）, 以及14天中收集的来自具有增加的（PC+）或者降低的PC（PC-）L-Exo或者H-Exo纳米颗粒，在此期间，小鼠被饲喂HFD日粮（n = 5/组）。

由于我们已经观察到的H-Exo中PC水平的动态变化，我们研究了外泌体脂类在调节胰岛素敏感性过程中的作用。为了这个目的，我们从L-Exo和H-Exo（2 × 10⁹外泌体）的总脂类中生成了纳米颗粒。为了产生具有降低PC的H-Exo来源的纳米颗粒，来自外泌体的总脂类从氯仿中被提取并通过薄层色谱（TLC）进行分离（补充图5l）并且该PC条带随后从H-Exo中（H-Exo^lipidsPC-）消除，而等量的商业化PC（40nmol）被加入L-Exo（L-Exo^{lipids PC-}）。该条带包括的PC（补充图5l，用红色长方形高亮表示）在TLC中的迁移被鉴别出来，之后被移除。该PC条带以及来自H-Exo脂类TLC剩余的脂类通过四级串联质谱进行谱学分析（补充数据3）。这些脂类纳米颗粒被口服喂给HFD饲喂的小鼠14天，而这些纳米颗粒在14天的处理期中再一次对小鼠的体重无作用（补充图5m），但是GTT和ITT结果表明服用H-Exo脂类或者L-Exo脂类^PC+的小鼠与服用L-Exo脂类或者H-Exo脂类^PC-的小鼠表现出葡萄糖的不耐受性和胰岛素抗性（图2m）。虽然甘油二酯，神经酰胺，以及酰基辅酶被报道作用于胰岛素抗性，但是包含PC的条带对于这些脂类均没有检测到。由于PC的移除， PC水平和剩余脂类没有受到影响，所以神经酰胺，甘油二酯，以及酰基辅酶在H-Exo和L-Exo中没有发生显著的改变（补充图5n-p）。这些结果表明HFD-诱导的外泌体升高可作用于胰岛素抗性和葡萄糖不耐受性。由于从H-Exo中提取出的由总脂类制作的纳米颗粒与被肝脏细胞摄入的胰岛素介导的葡萄糖与相似效应的H-Exo相同（补充图5q），H-Exo蛋白和RNAs的效应在胰岛素抗性中的效果在此研究中未被进一步研究。

4.CD63⁺A33⁺外泌体PC调节外泌体对于肝脏细胞的靶向性

为了考察肠上皮细胞来源的外泌体怎样调节内脏-肝脏间交流，我们建立了小鼠结肠上皮细胞系（GFP-MC38），该细胞系可释放GFP-阳性的外泌体（补充图6a），外泌体大小为110 ± 45nm（补充图6b，c），这些外泌体对于CD63，CD9和A33而言为阳性（补充图6d）。接着我们将GFP-MC38细胞（5 × 10⁵）注射到C57BL/6小鼠的结肠中。注射后6周，我们发现了肿瘤，然后处死了该小鼠，收集器官，采用共聚焦显微镜观察，在肝脏中发现注射的GFP-MC38外泌体确实到达了肝脏（图3a）。

接着，我们通过在多个时间点采用针对活体小鼠成像的DIR和PKH-26荧光染料双标记H-Exo和L-Exo（2 × 10⁹个外泌体）（补充图7a），确定了通过口服灌药摄入的内源性的内脏上皮细胞外泌体是否与结肠注射的GFP-MC38外泌体具有相似的路径。在口服30分钟内，DIR标记的外泌体在外周血中被检测到，并在6h达到峰值，在48h时开始下降（补充图7b）；DIR外泌体在口服后96h在血液循环中无法检测到（补充图7c）。我们在小鼠口服H-Exo或L-Exo后48小时，处死小鼠，收集器官成像（补充图7d），而扫描获得的器官图像表明标记的H-Exo或者L-Exo与在其它器官中检测到的信号相比，可携带最强的信号转移到肝脏。共聚焦图像分析表明肠上皮细胞外泌体通过门静脉转移到肝脏但并不通过淋巴系统进行转移（补充图8a，b）。DIR标记的PC纳米颗粒通过灌服喂给小鼠，6h后，我们对DIR信号进行度量，结果表明~60%的纳米颗粒在灌药后6h的内到达肝脏（补充图8c）。在分子水平，四级串联质谱分析表明肝脏PC，TAGs，DAGs，以及TAGs的脂酰链增加，同时神经酰胺类物质降低（补充图8d）。

之后我们进一步探索并鉴定了外泌体受体细胞，分离了上述的小鼠肝脏细胞并采用抗白蛋白抗体进行染色（肝脏细胞标记），同时采用F4/80标记（一个针对巨噬细胞或Kupffer细胞的标记）并通过流式细胞仪进行分析。流式细胞分析表明大多数的L-Exo（> 80%）被肝脏细胞吸收（图3b，L-Exo栏目），远远少于被F4/80阳性的巨噬细胞所吞噬的数量（~12%），而大多数的H-Exo（> 64%）被F4/80-阳性巨噬细胞所吞噬相比，~39.5%被肝脏细胞所吸收（图3b，H-Exo栏目），这些结果与共聚焦显微镜产生的结果一致（图3c）。相比其他抑制素，~88%通过吞噬作用吸收的H-Exo会受到细胞松弛素D的抑制（图3d），而我们采用共聚焦显微镜在肝脏细胞和Kupffer细胞内进行进一步确认吸收的L-Exo和H-Exo（补充图9a，b）。添加细胞松弛素D时与H-Exo共培养的Kupffer细胞表现出对H-Exo吸收的抑制作用（补充图9c）。

对于细胞系的共聚焦成像进一步表明肝脏细胞（人类HepG2和小鼠FL83B细胞）优先吸收L-Exo，而人类单核细胞（U937细胞）优先吸收H-Exo（补充图9d-f）。由于H-Exo富集PC，通过研究PC从H-Exo中消除过程中的效应，我们进一步研究了PC是否在调节特定细胞类型分泌的外泌体过程中发挥作用。纳米颗粒采用包含PC条带（PC-）的方法或通过添加已知量（40nmol）合成PC（PC+）的方法制备，然后我们将纳米颗粒用PKH26染料进行标记并与初级肝脏细胞和Kupffer细胞共孵育16h。流式细胞分析结果（图3e）表明在服用L-Exo^lipidsPC+后向L-Exo中加入PC脂类导致初级肝细胞摄入外泌体的显著下降（从88.8到27.8%），而从H-Exo脂类中移除PC（H-Exo^{lipids PC-}）增加了其被初级肝脏细胞吸收的比例（从40.8到72.9%）。在Kupffer细胞中（图3f），从H-Exo中移除的PC导致了外泌体摄入的下降（从72.3%到19.2%），同时在L-Exo中加入PC脂类可导致其摄入的增加（从16.8%到67.8%）。因此，这些结果表明通过特殊的肝脏细胞类型摄入的CD63⁺A33⁺外泌体依赖于其脂类组成，特别是其包含的PC脂类的比例。

图3 基于外泌体脂类组成的肝脏细胞的CD63⁺A33⁺的摄入

(a) 在注射GFP-MC38上皮细胞到结肠后的小鼠肝脏细胞GFP-阳性外泌体共聚焦成像。DAPI被用于细胞和染色。每个数据点采用三角形表示。(b) 流式细胞分析PKH-26-标记的肝脏细胞对外泌体的摄入（白蛋白⁺）以及Kupffer细胞（F4/80⁺）。实心三角形—L-Exo，实心矩形—H-Exo。(c) PKH26-标记的外泌体通过共聚焦显微镜在肝脏细胞/白细胞⁺/绿色（黄色箭头）进行可视化同时Kupffer细胞/F4/80/紫色（白色箭头）（左边）。每种细胞类型摄入的总的外泌体的比例在右侧进行总结。比例尺如图所示。每个数据点采用三角形进行度量。(d) 在加入内吞作用抑制素和去除内吞作用抑制素后对与PKH-标记的H-Exo共培养16h的Kupffer细胞进行流式细胞分析。PKH26⁺Kupffer细胞的比例在下图中进行总结。(e-f) PKH26标记的纳米颗粒与初级肝细胞（上图，e）和Kupffer细胞（下图，f）进行共孵育。细胞采用流式细胞仪进行分析，PKH-26-阳性细胞的比例采用右图总结的纳米颗粒进行处理后进行评估。圆圈—采用L-Exo的总脂类制作的纳米颗粒；三角—H-Exo脂类；上三角—H-Exo脂类消除的PC，下三角—L-Exo PC添加后。

一旦通过对肝脏进行靶向定位的CD63⁺A33⁺外泌体被确定，我们评估了它对于葡萄糖合成代谢的效应。特别的，外泌体通过初级肝脏细胞对于葡萄糖吸收的效应被进行评估。对葡萄糖吸收的抑制在用L-Exo处理的肝脏细胞与用H-Exo处理后的肝细胞的效果被进行对比和观察（补充图9g）。由于高胰岛素-正常钳夹实验表明H-Exo的服用会影响肝脏，WAT，以及肌肉组织，这些结果在体外小鼠的肝脏细胞中进行了进一步的确认（FL83B细胞），脂肪细胞（3T3-L1），以及肌肉细胞系（C2C12）。一个16h的H-Exo或者T2D-Exo对这些细胞系的处理表现出葡萄糖吸收的抑制（补充图9h-j）。进一步的，采用H-Exo，H-Exo^lipids，以及L-Exo^{lipids PC+}处理的FL83B细胞与L-Exo和H-Exo^{Lipids PC-}相比可吸收较少的葡萄糖。这些结果表明H-Exo和H-Exo^lipids阻止了葡萄糖在小鼠初级肝脏细胞中的吸收（补充图9k）。

5.H-Exo激活的巨噬细胞可增加TNF-α以及IL-6在血浆，肝脏，和脂肪组织中的生成

促炎症细胞因子通过抑制胰岛素的信号转导作用于肝脏的胰岛素抗性。接着，我们研究了外泌体是否对于细胞因子谱具有效应。H-Exo相对于L-Exo的处理可导致一系列在血浆和WAT中检测出的炎症因子被诱导，包括TNF-α和IL-6，上述两个因子可作用于胰岛素的抗性（图4a, b；补充数据4），而增加的TNF-α和IL-6水平在经过H-Exo处理后进一步通过血浆ELISA的方法被确认（图4c）。根据细胞因子含量从饲喂HFD小鼠的粪便中分离出CD63⁺A33⁺的外泌体，无菌小鼠饲喂CD63⁺A33⁺外泌体14天后，其肠道和肝脏组织中的TNF-α和IL-6被进行定量分析（补充图10a）；但是，在肠道组织中未发现任何显著的差异（补充图10b）。

总之，我们的发现表明通过肝脏巨噬细胞吸收的H-Exo可能导致巨噬细胞激活以及后续的TNF-α和IL-6的释放，从而导致胰岛素抗性的不断增强。为了确定巨噬细胞是否在H-Exo介导的胰岛素抗性中发挥作用，我们测定了巨噬细胞在用H-Exo处理的小鼠中被消耗的情况，而巨噬细胞的消耗导致了TNF-α和IL-6水平的下降（补充图10d）；另外，胰岛素的敏感性未被消耗并且通过H-Exo处理的小鼠有所提高（图4d），但是这种提高仅仅是在一个时间点上（在胰岛素注射后60分钟）发现具有显著差异。这些结果表明响应H-Exo而释放的巨噬细胞因子可能部分作用于胰岛素抗性。

巨噬细胞的激活在肝脏胰岛素抗性中发挥了病理性的作用。接着，我们研究了由H-Exo或者L-Exo处理的巨噬细胞释放的细胞因子在肝细胞葡萄糖吸收方面的作用。首先，我们确定了导致肝细胞葡萄糖吸收抑制的H-Exo的最小浓度。葡萄糖吸收分析结果表明显著抑制葡萄糖吸收的H-Exo最小剂量为5 × 10⁵（图4e）。将升高剂量的H-Exo处理的巨噬细胞培养液的上清液加入肝脏细胞中能够进一步降低了其葡萄糖的摄入量。但是，当采用L-Exo处理的巨噬细胞的上清液加入到肝脏细胞后没有观察到葡萄糖摄入量的下降（补充图10e）。另外，由H-Exo总脂类（H-Exo^lipids）和合成的PC（34:2）（补充图10f）产生的纳米颗粒对于葡萄糖摄入和H-Exo具有相似的效应。中和巨噬细胞上清液中的TNF-α和IL-6（图4g）可提高葡萄糖的摄入，表明巨噬细胞可提高葡萄糖摄入量，表明巨噬细胞来源的TNF-α和IL-6与H-Exo一起在抑制肝脏葡萄糖摄入方面发挥了叠加的作用。

6.AhR作用于H-Exo诱导的胰岛素抗性

AhR是一种配体激活的转录因子，可整合饮食和代谢信号以控制转录后流程，包括肝脏细胞中的胰岛素信号转导通路。我们通过Affymetrix（GSE156848）芯片以及qPCR结果研究了H-Exo是否可改变AhR在小鼠肝脏中的表达，研究结果表明在灌服H-Exo后编码AhR的基因上调（图5a）。AhR蛋白的诱导通过Western Blot分析进一步的进行了确认（图5b）。来自H-Exo脂类（H-Exo^lipids）的H-Exo和纳米颗粒进一步在小鼠肝脏细胞中诱导AhR蛋白的产生（图5c）。在FL83B细胞中诱导AhR同样以一种PC-剂量依赖的方式被证实（图5d）。在采用PC（34:2）处理的小鼠肝脏细胞中葡萄糖的摄入以PC-剂量依赖的方式被抑制（图5e）。这些结果表明PC介导的肝细胞葡萄糖摄入的抑制与AhR的诱导有关。

我们接着研究了PC是否会与AhR结合。我们采用表面等离子体共振（SPR）技术验证了该假设。H-Exo来源的总脂类（图5f）和PC（34:2）脂类（图5g）被固定于LIP-1传感器，同时我们制备了重组的AhR蛋白并覆盖了该固定的脂类（纳米颗粒）。正如图5f所示，SPR峰值表明AhR蛋白与H-Exo脂类和PC（34:2）脂类纳米粒子进行互作，但是L-Exo脂类纳米粒子间不发生互作（补充图11）。包被于ELISA板的PC（34:2）脂类可进一步与充足的AhR蛋白共孵育并通过抗AhR抗体进行检测（图5h）。然后，PC与AhR的结合通过固定的NTA芯片上重组的AhR（蛋白质感受器）进行证实；H-Exo^{lipids PC-}和PC（34:2）^lipid被覆盖于固定的AhR上（图5i）。我们进一步研究了H-Exo的处理是否也导致了AhR活性的增加（磷酸化），共聚焦成像数据表明PKH26标记的H-Exo与外泌体标记CD63进行共定位（补充图12a）。外泌体与AhR进行共定位的特异性被进一步通过PKH26-标记的H-Exo进一步证实（补充图12b），导致了H-Exo与AhR在肝脏细胞质内的共定位。简单混合等量的PKH26染料和H-Exo（补充图12c）不能导致AhR的共定位（图5j）。肝脏细胞的共聚焦图像进一步的表明磷酸化的AhR（pAhR）在经过H-Exo处理后在细胞核内含量增加，而pAhR并未在L-Exo和PBS处理中被发现受到诱导（补充图13a）。AhR的激活也通过H-Exo诱导AhR下游目标基因（Cyp1a1，Cyp1a2和Cyp1b1）而表明（补充图13b）。来自肝脏细胞系的Western blot分析数据采用初级肝脏细胞生成（补充图13c）。

肝脏巨噬细胞也可吸收H-Exo，所以我们接着确定了肝脏中巨噬细胞AhR的表达是否由于H-Exo的吸收而诱导。我们用qPCR分析了AhR，TNF-α和IL-6在肝脏巨噬细胞中的表达，并表明TNF-α和IL-6的增加在诱导AhR之前（3h，6h相对12h）。这个结果表明AhR的表达被诱导但AhR的诱导是在激活巨噬细胞之后（补充图14a-c）。

采用AhR缺失（AhR^-/-）小鼠后，我们接着检测了AhR在H-Exo介导的胰岛素抗性中的作用。在AhR^-/-小鼠中，H-Exo不能损坏葡萄糖的耐受性或胰岛素的响应性，不同于其对于野生型C57BL/6小鼠的效应（图5k）。在AhR^-/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠中我们未观察到体重的差异（补充图14d），表明在抑制AhR^-/-小鼠中抑制H-Exo介导的胰岛素抗性很可能不是由于体重的变化，而在H-Exo处理的AhR^-/-小鼠肝细胞中葡萄糖的摄入相对于L-Exo处理与C57BL/6小鼠肝细胞不同（图5l，m）。为了进一步证实肝细胞AhR在H-Exo-介导的胰岛素抗性中的作用，我们对AhR^-/-小鼠进行了尾静脉注射Ad-AhR或者Ad-GFP（5 × 10⁹/小鼠溶于200μLPBS）。AhR蛋白在采用Ad-AhR处理小鼠的肝脏组织中可被检测到，但是在Ad-GFP（补充图14e）注射后7天内未被检测到。在注射后第3天开始，灌服H-Exo14天的小鼠表现出葡萄糖不耐受并对胰岛素响应下降（图5n）。这些结果表明H-Exo PC通过过表达和后续的激活AhR作用于胰岛素抗性。

图4 肝细胞和巨噬细胞之间的相互作用作用于胰岛素抗性

(a) 受到CD63⁺A33⁺外泌体（L-Exo或者H-Exo）处理14天的小鼠血浆和WAT细胞因子谱。(b) H-Exo相对L-Exo诱导血浆细胞因子表达的倍数变化显示出多于两倍的变化。红色柱子显示已知参与胰岛素抗性的细胞因子/因子比值。(c) TNF-α（左图）和IL-6（右图）上调表达之后的采用H-Exo处理通过血浆中的ELISA进行证实。实心圆—PBS，实心三角—L-Exo，实心长方形—H-Exo。(d) 在通过14天的摄取外泌体的过继转移后，对进行或未进行巨噬细胞消耗的C57BL/6小鼠进行ITT处理。实心长方形—采用H-Exo处理的巨噬细胞消耗的小鼠；实心菱形—未进行巨噬细胞消耗的用PBS处理的小鼠，实心圆形—用H-Exo处理的未进行巨噬细胞消耗的小鼠。(e) 在采用不同浓度H-Exo培养的肝脏细胞中进行的葡萄糖摄入分析（如图所示）。(f) 在添加来自含有来自H-Exo总脂类（H-Exo Nano）和PC（34:2）纳米颗粒的巨噬细胞培养液小鼠肝脏细胞上清液的葡萄糖摄入分析。(g) 来自H-Exo处理的巨噬细胞的上清液（单核细胞 + 5 × 10⁶）被与抗TNF-α/抗IL-6抗体预中和。被在预中和上清液存在状态下肝脏细胞摄入的葡萄糖含量被进行估计。

7.H-Exo摄入影响了胰岛素信号转导并导致胰岛素抗性

胰岛素抗性的特点是对多个代谢器官，包括肝脏，脂肪组织，骨骼肌中胰岛素信号转导的损伤。葡萄糖钳分析（见图2b-i）表明胰岛素响应在三个主要的代谢器官（肝脏，WAT和肌肉中）的H-Exo受体小鼠中被损伤，我们进一步采用qPCR对这些代谢器官中调节胰岛素的通路进行定量分析。H-Exo处理可导致Ptpn1，Igfbp1，Jun和Ldlr表达量上升，IRS-1，IRS2，Pparg和Srebf1（图6a，b）相比L-Exo处理的小鼠在肝脏中的表达量下降。细胞因子芯片分析同样表明H-Exo处理导致TNFα和IL-6表达量的上升以及IL-10在WAT组织中相比L-Exo处理的小鼠表达量的下降（补充图15a）。在受到H-Exo影响的基因的表达中，IRS-1和IRS2的下调作为H-Exo处理的结果在WAT和肌肉组织中被证实（补充图15b，c）。抑制IRS-2的活性通过Western blot度量组织提取物（包括肝脏，WAT，和肌肉）中pIRS-2的水平而被阐明（图6c）。与野生型B6小鼠不同，AhR^-/-小鼠灌服H-Exo不会导致IRS2在肝脏，脂肪组织，和肌肉组织（图6d）表达的抑制，表明H-Exo介导的IRS2抑制通过AhR受体介导的通路发生。

胰岛素的行为通过结合其同源受体而引发，而被激活的受体招募并磷酸化一系列的底物分子。其中，IRS-1和IRS-2似乎是适配体分子，在偶联PI3K-

图5 HFD诱导的CD63⁺A33⁺外泌体脂类以AhR依赖的方式作用于胰岛素抗性

（a） 代表性的基因表达来自口服外泌体14天的Affimatrix肝脏组织芯片热图。诱导AhR表达在红色框中高亮表示。升高的AhR基因表达通过qPCR进行确认（柱状图，右侧，n=3）。实心三角—L-Exo，实心长方形—H-Exo。（b） 肝脏组织中总AhR蛋白表达通过Western blot进行证实。（c） 在与L-Exo，H-Exo，L-Exo^lipids，或H-Exo^lipids共培养的肝脏细胞中（FL83B细胞）磷酸化的AhR（pAhR）蛋白表达。显微测密术检测结果在下图中总结。实心圆圈—PBS，实心三角形—L-Exo，实心长方形—H-Exo。（d） FL83B细胞与不同浓度的PC（34:2）共培养16h，其对于AhR表达的效应通过Western blot进行确定。对于β-actin蛋白的比率在中间以数字的形式显示。（e） 针对与各种不同浓度PC（34: 2）共培养的FL83B葡萄糖摄入分析。（f-g） SPR感应图表明AhR重组蛋白与来自H-Exo的总脂类互作的情况（f）以及与PC（34: 2）互作的情况（g）。（h） PC直接结合AhR蛋白。（i） SPR与AhR蛋白共同作用，包被NTA芯片，H-Exo^{lipids PC-}以及PC（34:2）^lipid在流动相下运行。（j）AhR在细胞质中的表达相对于采用L-Exo或H-Exo共培养的小鼠肝脏细胞的细胞核。在通过L-Exo或者H-Exo处理后对细胞质的密度计量分析（左图）相对于细胞核（右侧）AhR蛋白表达。（k）GTT和ITT在采用CD63⁺A33⁺外泌体（L-Exo或者H-Exo）处理后14天后AhR（AhR^-/-）HFD饲喂的小鼠。（l-m）在AhR敲除（AhRKO, l）后葡萄糖摄入分析以及野生型（m）FL83B细胞。（n） AhR^-/- 小鼠的GTT和ITT伴随AhR在肝脏细胞中通过腺病毒（5 × 10⁹ pfu）通过尾静脉注射后的重表达。小鼠通过口服灌药发饲喂H-Exo14天同时饲喂HFD。

PKB下游激酶过程中发挥了主要作用。酪氨酸磷酸化的IRS-1/2可招募异二聚体p85/p110 PI3K至浆膜上，并产生脂类第二信使PIP3。这种行为也可激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（PKB）/Akt，其中Akt可调节胰岛素刺激的葡萄糖的转运，导致葡萄糖摄入量的增加。我们的数据显示H-Exo和PC的处理不仅抑制了胰岛素介导的IRS-2，同时也导致PI3K和Akt磷酸化活性的下降，这在胰岛素信号介导的摄入葡萄糖的过程中发挥了重要作用（图6e，f），而IRS2是响应性的适配体分子可激活PI3K和Akt。这些效应在AhR^-/-小鼠（图6f）中的废弃表明AhR与胰岛素信号通路间的相互作用。

AhR进一步参与胰岛素信号转导通路及其下调IRS-2表达的其他证据通过AhR^-/-小鼠提供，AhR通过Ad-AhR尾部注射重新表达。来自这些鼠肝脏提取物的Western blot表明AhR的重表达导致pIRS2蛋白质水平的下降（图6g）。

最终，为了确认IRS-2是否参与了H-Exo介导的葡萄糖摄入的抑制过程中，我们在肝脏细胞，分化的3T3脂肪细胞，以及鼠肌肉细胞中中过表达了IRS-2。在用肝脏，脂肪组织进行研究时，或在L-Exo和PBS处理的小鼠（图6h，i）中进行研究时，我们在H-Exo处理的小鼠肌肉组织提取物处理的IRS-2过表达的肝脏细胞，脂肪细胞，或者鼠肌肉细胞中观察到无葡萄糖摄入的抑制。该结果表明IRS-2对于H-Exo介导的葡萄糖摄入的抑制为关键基因。

我们也注意到与IRS2不同，受到H-Exo影响的肝脏中的其它基因不具有与脂肪组织和肌肉组织相似的模式（见图6a, b）。然后，对于该差异是否与H-Exo信号的密度在每种器官中具有相关性被进行了进一步的研究，体内成像结果表明H-Exo信号密度（图6）与肝脏中最高密度和肌肉中最低密度不同。

表达的基因的倍数变化在图6k中列出，与H-Exo信号密度一致，除了LDLR，INS1，和UCP1。总之，这些结果表明H-Exo处理导致了调节胰岛素信号转导通路在所有代谢组织中基因表达量的改变，H-Exo介导的基因表达的改变是组织依赖的。

图6 H-Exo影响肝脏，脂肪，以及肌肉组织的信号转导

(a) 针对接受14天口服CD63⁺A33⁺外泌体小鼠肝脏，脂肪组织，以及肌肉组织PCR芯片（Qiagen）胰岛素信号转导热图的基因表达。(b) 来自用PBS，L-Exo和H-Exo（n=3）处理的肝脏组织中上调和下调表达的基因。实心圆圈—PBS，实心三角—L-Exo，实心长方形—H-Exo。(c-d) pIRS-2在从C57BL/6小鼠肝脏，脂肪，以及肌肉提取物中进行Western blot （c）以及AhR^-/-小鼠（d）与β-actin的比值在中间显示。(e-f) PI3K, pAKT以及AKT在从C57BL/6和AhR^-/-小鼠肝脏组织进行的Western blot。与β-actin的比值在中间显示。(g) AhR通过尾部注射Ad-AhR（腺病毒）在肝脏中进行了重新表达。小鼠采用L-Exo和H-Exo处理14天。肝脏裂解物种中pIRS-2水平通过Western blot进行检测。与β-actin的比值在中间显示。(h-i)葡萄糖摄入在采用对照（h）或者IRS2（i）质粒（n = 3）转染的肝脏细胞，脂肪细胞和肌肉细胞进行处理（n = 3）。(j) DIR标记的外泌体对肝脏，WAT，肌肉的扫描图。(k) 组织特异的以及调节胰岛素转导的H-Exo依赖的基因表达的改变。表达量以比较的方式在PBS处理的小鼠（n=3）中显示。圆圈—肝脏，长方形—WAT，以及下三角—肌肉。

8.H-Exo介导的AhR的激活导致小鼠中的血脂障碍

由于AhR参与了胆固醇的合成过程，高脂肪摄入可诱导胰岛素的抗性和血脂障碍，包括高胆固醇和甘油三酯。我们接着评估了来自HFD饲喂小鼠用H-Exo或者L-Exo处理14天后出现的肝脏脂肪变性，血浆胆固醇甘油三酯，ALT，以及AST水平。H&E对H-Exo受体小鼠肝脏组织的染色相比PBS或L-Exo受体小鼠表现出肝脏脂肪变性的现象（图7a）。H-Exo处理的C57BL/6和C57BL/6无菌小鼠表现出显著升高的血浆胆固醇和甘油三酯的水平，而AhR^-/-小鼠表现出血浆胆固醇和甘油三酯水平无明显变化（图7b）；另外，血浆ALT和AST水平在H-Exo处理的小鼠相对PBS和L-Exo处理的小鼠表现出显著的升高，该结果与肝脏损伤有关（图7c）。总之，这些结果表明激活AhR介导的信号转导可作用于H-Exo诱导的血脂障碍和肝脏损伤。 

图7 C57BL/6和C57BL/6无菌小鼠，但非AhR^-/-小鼠中H-Exo诱导的肝脏脂肪变性和血脂障碍

(a) H&E对小鼠肝脏组织切片的染色在接受PBS，L-Exo，或H-Exo14天后的情况。蓝色箭头表明脂肪变性。比例尺为20μm。数据至少重复3次。(b) 血浆中胆固醇和甘油三酯在经过外泌体处理14天后的水平（n = 5）。实心圆圈—PBS，实心三角—L-Exo，实行长方形—H-Exo。(c) 血清中ALT和AST水平（n = 5）。(d) 模型：HFD饲喂的小鼠通过AhR介导的通路释放诱导胰岛素抗性和葡萄糖不耐受CD63⁺A33⁺外泌体小肠上皮细胞模型。

讨论

在本研究中，我们证实了HFD影响了小肠上皮外泌体的组成。事实上，H-Exo PC在SPF和无菌小鼠模型中胰岛素抗性的发展方面发挥了作用。H-Exo的效应通过消耗外泌体PC而减弱了，表明人类胰岛素抗性可通过饮食诱导的肠道外泌体脂类的改变而进行介导。

PC的过量生产与人类代谢疾病有关，我们发现日粮依赖的外泌体PC的增加在临床上可用，这是因为异常高和异常低水平的PC在不同组织中都可能影响能量代谢病与疾病的发展相关。进一步的研究需要聚焦于确定健康日粮是否在降低肥胖/早期2型糖尿病人外泌体PC以阻止胰岛素抗性方面发挥作用以及外泌体PC是否可被用于2型糖尿病以及代谢相关的肝脏疾病诊断的分子标记。另外，外泌体受体细胞中释放的代谢物是否具有有害或者有益的效应需要在体内和体外进一步研究。我们发现外泌体中较高的PC浓度可导致更多的外泌体被巨噬细胞捕获，这提供了一种可编辑的外泌体靶向各种不同分子运载工具的策略。

各种不同种类的PC分子在哺乳动物细胞中存在，这是由于PC的组分可被重新塑造以配合棕榈酸（PA）。PA与脂类结合不是由PA的绝对摄入量所决定的，而是通过不同类型的脂肪酸（FA）之间比例而决定的。因此，PC在外泌体中的一个结论性的作用即是否PC的修饰参与了H-Exo介导的胰岛素抗性需要被进一步研究。

PEMT将PE转化为PC，这种物质存在于内质网和线粒体相关的膜上。缺乏PEMT的小鼠具有较低水平的PC并且被保护不患HFD诱导的肥胖和胰岛素抗性。我们的研究结果表明PC在饲喂HFD日粮的小鼠肠道外泌体的增加与PEMT水平的增加相关。这些发现为进一步研究健康饮食是否对PEMT在肠道上皮细胞中的表达具有抑制效应提供了基础理论，而其它具有高脂肪或高糖的饮食可通过AhR激活增强PEMT的表达。

PC的游离形式不具有特异的靶向性，PC功能在线性梯度稀释的方式下下降。在本研究中，我们证实了与其它细胞相比，肝脏噬菌体和肝脏细胞可吸收更多的由H-Exo携带的PC。因此，游离PC对于宿主的生物学效应可能与外泌体携带的PC不同。

肝脏已经进化出精细的感觉机制，可通过内脏/肝脏轴检测来自消化道菌群的信号。我们提出AhR是肝脏细胞表达的一种生物学感受器的观点，当肝脏AhR-介导的对消化道代谢物进行检测时，比如外泌体，激活的AhR与转录因子间的相互作用可以再次肝脏细胞的代谢病对细胞转录组进行重编程。基于与AhR结合的配体的类型，不同的转录因子可彼此间进行选择性的相互作用。

我们证实了由H-Exo携带的PC与AhR在受体细胞中相互作用。我们的数据进一步表明H-Exo调节了大量肝脏基因的表达，包括IRS-1，IRS2，PPARγ，Srebf1，Lep，Jun和Ldlr都在胰岛素信号转导通路中发挥了重要作用。在这些基因中，IRS-2对于下游胰岛素信号传导机制是一个关键基因，这些IRS-2下游的基因包括PI3K和akt，激活Akt可增加葡萄糖的摄入。我们的结果表明H-Exo抑制了IRS-2的表达并通过AhR信号转导通路阻止了Akt的激活。敲除肝脏细胞中的AhR导致H-Exo介导的IRS-2表达和葡萄糖吸收的抑制，表明H-Exo介导的AhR激活导致了一系列包括IRS-2在内以及其他列在图6b中的基因的激活。综上，这些基因通过H-Exo介导的激活AhR通路发挥作用并作用于胰岛素信号转导的调节。这些发现为进一步的研究提供了基础，健康饮食是否能够阻止H-Exo介导的IRS-2的抑制同时阻止潜在的内脏通过肠道外泌体与不仅肝脏而且多种诸如脂肪和肌肉组织相互作用的分子机制。

H-Exo PC诱导的AhR信号激活作用于胰岛素抗性，即使在通过诱导FGF21加剧肝硬化的情况下，AhR和AhR转基因小鼠中的构成性表达已被显示提高了胰岛素的敏感性。AhR是一种配体激活的转录因子，被饮食中提供的小分子，微生物，代谢产物以及污染物所激活。大量研究证实了AhR功能的控制受到AhR通常参与了平衡相反进程的挑战。因此，基于激活AhR因子的性质，具有不同功能的各种基因可通过AhR的激活而被引发。

在本文，我们的研究集中于H-Exo PC在一种HFD引发的胰岛素抗性中的作用，我们的发现HFD同时也改变了外泌体的组成并提供了由于HFD饲喂导致的肥胖相关的代谢综合症，心脏病，中风改变的外泌体脂类，蛋白，以及RNA谱进一步的研究机会，哪些来自HFD的因素可进一步导致H-Exo组成的改变需要被进一步的研究。

我们的数据也表明从肠道上皮细胞中释放的外泌体主要被转运到肝脏，但少量的外泌体也被转运到脂肪和肌肉组织中。但是，肿瘤细胞来源的外泌体更倾向于对靶向免疫器官进行可能的免疫调节，比如免疫抑制，这是一个广为人知的肿瘤免疫逃逸的潜在机制。相反，我们的发现表明从HFD饲喂的小鼠小肠上皮细胞中释放的外泌体使内脏/肝脏/脂肪/肌肉组织轴的交流失调。该研究为进一步的鉴别靶向免疫器官肿瘤外泌体潜在的分子机制以及非肿瘤外泌体靶向器官比如肝脏提供了基础。

我们同样观察到血液循环中的外泌体PC在HFD饲喂的小鼠中增加。这个发现为进一步研究H-Exo PC对于是否来自HFD饲喂小鼠血液循环中外泌体在胰岛素抗性方面是否具有作用提供了理论基础。但是，血液循环中的外泌体是一种混合物，可通过各种组织中的细胞分泌，包括肠上皮细胞，脂肪细胞，肝脏细胞，肌肉细胞以及很多其它组织。分离并从血液循环和混合的外泌体中制备足够的细胞特异外泌体亚群用于这种性质的研究在技术上是具有挑战性的。与血液外泌体相反，大量的粪便外泌体从肠道上皮细胞中分泌。每天释放的粪便外泌体是肠道菌群中的一个主要亚群（每日收集的1g粪便/20g小鼠体重，4×10¹⁰CD63⁺A33⁺外泌体/g粪便）。此外，向肠道中释放外泌体的组织较少；因此，粪便外泌体是一种相当纯的外泌体群体。粪便外泌体优于血液外泌体的另一个优点是相对大量的粪便纳米颗粒可采用CD81和CD9标记基于CD63阳性或阴性进行分离（CD63^-A33⁺），使得在采用相同的研究方法研究这些外泌体亚集在调节胰岛素信号转导成为可能。

大量的粪便外泌体也为研究很多纳米囊泡从消化系统转运至循环系统过程中具有挑战性的问题提供了足够的材料。内源性外泌体，比如肠道上皮外泌体的吸收，或外源性纳米颗粒，比如可食用的植物外泌体样纳米颗粒的吸收，都是一个纳米囊泡从GI通道转运至潜在的上皮细胞并进一步通过门静脉或者淋巴系统转运到全身血液循环和各种组织的过程。有几种潜在的不可消化的纳米囊泡在经过上皮并进入全身血液循环过程中可能会经历的吸收通路，比如，细胞旁转运，跨细胞转运，以及吸混作用。但是，目前，即使很多研究都运用了不同的体外细胞模型，但可解释某种特定的完整纳米囊泡体内吸收通路的机制仍然未知。可以想象完整的纳米囊泡仅当它们能够成功的穿过覆盖上皮的粘膜层时可能在上皮层被吸收。粘液素分子制造了一个分子筛能够阻止特定的过大的分子穿过黏液层孔隙（~200nm）。因此，颗粒大小在通过粘液层穿过完整纳米囊泡的过程中发挥了中心作用，而小于200nm的肠道外泌体亚集被认为会进入血液循环。另外，由于粘液分子表面的糖基基团上的负离子。这些粘液能够紧密的通过亲水性的和静电相互作用结合纳米颗粒。因此，亲水性以及纳米囊泡表面阳性的电荷不太可能穿过肠道上皮。肠道上皮外泌体为负电荷，可能对于足量囊泡穿过粘膜层是有利的。一旦完整的纳米囊泡穿过了粘膜层，它们可能会接着通过三种机制穿过上皮细胞：细胞旁转运（即在临近的上皮细胞间），跨细胞转运（即穿过上皮细胞），吸混作用（即通过死亡的或者正在死亡的细胞）。本研究得到的结果为进一步确定哪种潜在的上皮细胞外泌体从GI通道像血液中转运的机制是合理的提供了理论依据。

本研究中，C57BL/6小鼠采用H-Exo处理14天同时饲喂HFD表现为胰岛素抗性。相比RCD饲喂28天后出现胰岛素抗性的小鼠，HFD饲喂似乎加速了胰岛素抗性的发展。

综上所述，我们的研究（图7d）表明肠道外泌体在调节内脏和三种主要的代谢器官过程中的不同作用。饮食改变了肠道外泌体的组成和功能，胰岛素抗性在一个外泌体 PC依赖的通过激活AhR受体介导的通路中被引发。这些结果为未来研究肠道菌群来源的因子是否能阻碍PC募集到肠道外泌体中提供了依据，并且可能对预防和治疗2型糖尿病具有一定的意义。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33431899