编译：微科盟洛雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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日常生活中，我们常常会感觉便秘与衰老总是密切相关的，但尚未有相关实验和针对衰老和便秘机制的深入研究。本研究基于代谢组学和网络药理学探讨了衰老和便秘的相关性。对衰老和便秘大鼠的行为学实验分析表明，衰老大鼠不仅表现出明显的衰老行为，还有显著的便秘行为；而便秘大鼠也同时具有便秘和衰老行为。此外，作者进行了粪便代谢组学研究，发现23种代谢物与衰老有关，22种代谢物与便秘有关，其中有16种差异代谢产物，参与了11种代谢途径。基于网络药理学的研究方法，作者还探究了衰老和便秘的作用靶点及相关通路，结果表明癌症相关的信号通路是二者间最相关的信号通路。本研究为理解衰老和便秘的相关性提供了新颖的视角，为中西医中关于衰老和便秘之间的相关性理论提供了依据，同时为日后的临床研究提供了参考。
论文ID
实验设计
实验结果
1.衰老和便秘对大鼠食物摄入量及体重的影响
三组大鼠的初始体重没有差别(图1A)。NC组和AG组大鼠体重随时间的增加而增加，两组间无显著差异。而CG组大鼠体重增长明显低于NC组大鼠；同时，三组大鼠的食物摄入量没有明显差异(图1B)。在服用白醋一周后，CG组大鼠的食物摄入量急剧下降，而后恢复到与对照组相同的水平。
结果表明，D-半乳糖给药11周对大鼠体重和摄食量无明显影响。而白醋对大鼠有刺激作用，在短时间内可减少大鼠的食物摄入量。
图1 对照组(NC)、衰老模型组(AG)和便秘模型组(CG)的行为学实验结果图
(A)体重变化图；(B)摄食量变化图；(C)水迷宫实验图；(D)水迷宫逃避潜伏期；(E)水迷宫跨越平台的次数；(F)大鼠尿量；(G)首次排便时间；(H)胃排空率；(I)胃肠墨水推进率。数据以平均值±标准偏差(n=6)表示。*P<0.05，**P<0.01，与NC比较。
2.衰老和便秘使大鼠的运动能力和空间学习记忆能力下降
研究人员通过旷场实验检测大鼠的运动和探索行为，与对照组相比，AG组和CG组大鼠的总运动距离和站立次数均显著减少(表1)。结果表明，衰老和便秘降低了大鼠的运动能力。
研究人员采用Morris水迷宫测试各组大鼠空间学习记忆能力。首先，观察大鼠的运动轨迹，如图1C为第4天实验时大鼠的游泳路径图，可见AG组和CG组大鼠比NC组大鼠表现出更分散的路线和更长的潜伏期（寻找目标的时间）(图1C)。其次，在空间探索方面，与对照组相比，衰老大鼠和便秘大鼠穿越原站台的时间明显增加(图1D)，穿越站台的次数明显减少(图1E)，这暗示着衰老和便秘可使大鼠空间学习记忆能力下降。
表1 对照组大鼠、衰老组大鼠和便秘组大鼠的旷场实验结果(n=6，平均值±标准偏差)
3.衰老和便秘致大鼠胃肠功能障碍
研究人员通过检测肠排空时间及墨汁推进率来评估大鼠胃肠功能。三组大鼠的初始尿量和最终尿量均无差异(图1F)。三组大鼠首次排出黑色粪便的初始排便时间也无显著性差异(图1G)。
D-半乳糖给药11周后的AG组和CG组大鼠的排便时间明显延长。两组大鼠胃排空率也明显长于NC组(P<0.05；P<0.01)(图1H)。此外，AG组和CG组的肠道墨汁推进率明显降低(图1I)。这些结果表明，衰老和便秘均可使大鼠胃肠动力明显减弱。
4.衰老和便秘致大鼠氧化应激损伤
为研究衰老和便秘对大鼠氧化应激的损伤情况，作者采集大鼠血清样本进行生化指标检测。与对照组相比，衰老大鼠和便秘大鼠的血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）和过氧化氢酶（CAT）水平显著降低，丙二醛（MDA）活性显著升高(表2)。总体而言，衰老大鼠和便秘大鼠均表现出明显的氧化损伤，因而不能有效激活抗氧化因子及减少活性氧(ROS)的大量积累。
表2 对照组大鼠和衰老组大鼠的血清生化指标(n=6, 平均值±标准偏差)
5.衰老和便秘显著降低大鼠海马组织caspase-3的表达
研究人员用免疫组织化学法检测大鼠海马组织中caspase-3蛋白的表达。Caspase-3是介导细胞凋亡的核心蛋白酶, 是Caspases家族的核心成员。结果表明，衰老大鼠和便秘大鼠海马组织中caspase-3的表达均高于正常大鼠(图2D)。如图2A~2C所示，衰老和便秘组大鼠出现病理改变，对照组大鼠海马组织未见明显异常。
图2 对照组(A)、衰老组(B)和便秘组(C)大鼠的海马免疫组织化学染色图（400X）及其半定量统计图(D)数据以平均值±标准偏差表示(n=3)
6.衰老和便秘对大鼠的代谢产物谱的影响
本课题通过基于核磁共振氢谱（1H-NMR）的代谢组学技术测定衰老和便秘大鼠代谢产物成分及含量的变化。从NC组、AG组和CG组大鼠粪便的1H-NMR图谱中可以指认出46种代谢物(图3，表3)。
接下来作者首先采用PCA分析，结果表明NC组和AG组以及NC组和CG组之间的散点均有明显的分离(图4A)。然而，AG组和CG组之间并没有明显的分离(图4A)；同时，采用PLS-DA分析，以最大化组间的差异。获得比PCA更好的分离效果，并显示组间代谢差异。如图4所示NC与AG(R2Y=0.986，Q2=0.855)和NC与CG(R2Y=0.967，Q2=0.85)的PLS-DA模型是有效的，没有过度拟合(图4B)。
图3 对照组(A)、衰老组(B)和便秘组(C)大鼠的粪便样本的1H-NMR图谱
表3 大鼠粪便样本1H-NMR图谱中主要代谢产物峰归属
7.与衰老和便秘相关的差异代谢物分析
作者采用S-plot进行数据归一化(图4C)，其中VIP>1.2和P<0.05用于筛选与衰老或便秘相关的差异代谢物。与NC组相比，AG组大鼠粪便中23种代谢物的含量发生了显著变化，其中醋酸盐、α-木糖、胆碱、葡萄糖、乳酸、脯氨酸和苏氨酸含量较高，而2-氧戊二酸、丙酮、丙氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、柠檬酸、肌酐、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙酮酸和甘氨酸含量较低。与NC组相比，CG组大鼠粪便中有22种差异代谢物(图4C)，包括醋酸、α-木糖、精氨酸、丁酸、肉碱、胆碱、乙醇、葡萄糖、苯丙氨酸、牛磺酸和三甲胺-N-氧化物水平的升高，以及丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、柠檬酸、肌酐、谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丙酮酸和异亮氨酸水平的降低。
综上所述，与衰老和便秘相关的16种差异代谢物包括醋酸、α-木糖、丙氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、柠檬酸、肌酐、胆碱、谷氨酸、葡萄糖、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和丙酮酸(表4)。
图4 对照组(NC)、衰老组(AG)和便秘组(CG)大鼠粪便样本1H-NMR谱的多变量数据分析(A)PCA分析散点图，NC为蓝点，AG为红色五角星，CG为绿色三角形。(B)PLS-DA分析散点图(排列编号：200)，R2代表模型的可解释性，Q2是模型的预测能力。(C)衰老和便秘样品的S-Plot和SUS-Plot。PCA，主成分分析；PLS-DA，偏最小二乘判别分析；SUS图，共享与特有化合物结构分析图。
表4 衰老组和便秘组大鼠的差异代谢产物表达情况
8.衰老和便秘大鼠中特有及共有的差异代谢物
作者进一步应用SUS-Plot以整合OPLS模型(图4C)，与年龄相关的变量位于右下象限，而便秘相关的变量位于左上象限。结果表明，衰老大鼠中3种特有代谢物是乳酸、乙酰乙酸酯和甲酸盐，而便秘大鼠中特有代谢物有6种，包括精氨酸、肉碱、脯氨酸、肌醇、缬氨酸和α-木糖。衰老和便秘共有代谢物有18种包括丙氨酸、尿囊素、天冬酰胺、天冬氨酸、丁酸、胆碱、柠檬酸、瓜氨酸、葡萄糖、谷氨酰胺、甘氨酸、次黄嘌呤、甘露醇、蛋氨酸、丙酮酸、苯丙氨酸、苏氨酸和尿嘧啶。
9.受衰老和便秘影响的特有及共有代谢途径分析
进一步分析发现，衰老和便秘大鼠分别参与了14条和12条代谢途径。有11条共同的代谢途径，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、淀粉和蔗糖的代谢、苯丙氨酸的代谢、精氨酸和脯氨酸的代谢、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、精氨酸的生物合成和丙酮酸的代谢(图5)。
图5 老年组(AG)和便秘组(CG)差异代谢物及甲氨蝶呤(MetPA)相关通路分析简图
每个圆圈的大小和颜色分别基于基因数和P值。代谢途径如下：1，酮体的合成和降解；2，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；3，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；4，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；5，淀粉和蔗糖代谢；6，苯丙氨酸代谢；7，丙酮酸代谢；8，柠檬酸循环(TCA循环)；9，精氨酸和脯氨酸代谢；10，糖酵解/葡萄糖代谢；11，肌醇磷酸代谢；12，精氨酸生物合成；13，丁酸代谢；14，半胱氨酸和蛋氨酸代谢；15，牛磺酸和次牛磺酸代谢。
10.从行为学角度分析衰老与便秘的相关性
不同的动物行为之间往往存在某种内在联系(图6)。在本研究中，我们发现AG组大鼠在旷场实验中的站立次数与尿量和胃排空呈负相关。衰老大鼠的肠推进率与胃肠排空率呈显著负相关。衰老大鼠水迷宫试验中跨平台次数与肠推进率呈负相关，与旷场实验中的站立次数呈负相关。
而便秘大鼠的不同行为间的相关性更强。首先，便秘大鼠体重增长与自主神经活动、排泄行为、学习记忆能力、胸腺指数等6个参数显著相关。便秘大鼠的尿量与胃排空呈显著正相关，水迷宫实验中的潜伏期与胃排空和肠推进率显著相关。此外，自主神经活动与胸腺指数之间也存在显著的相关性。
图6 不同的动物行为之间的相关性热图
皮尔逊相关系数(R)的高低用颜色表示。阈值设置为|r|>0.5和P<0.05。“*”表示显著差异。红框表示正相关，蓝色框表示负相关。标有“a”的参数表示与便秘有关的粪便生物标志物，而没有任何标记的代谢物表示与衰老有关的粪便生物标志物。
11.衰老和便秘相关的GO分析和KEGG分析
首先，作者筛选了衰老和便秘相关的靶点，发现衰老相关靶点23989个，便秘相关靶点4636个；然后，通过David 数据库对筛选出的靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析，以分析衰老和便秘潜在靶点的生物学特性。针对衰老相关的靶点，GO富集为154个生物学过程(BP)、23个细胞组分(CC)和25个分子功能(MF)。针对便秘相关的靶点，GO富集为132个BP，32个CC，26个MF。根据筛选标准的要求（Count 2和EASE scores 0.1），在BP、CC和MF中前20名显著富集的类别展示在图7A。
为了探索衰老和便秘可能参与的信号通路，作者对衰老和便秘相关的靶点进行了KEGG富集分析，KEGG通路富集得到32条衰老和便秘共有的信号通路，图7B展示了前20个显著富集的通路。
图7 衰老和便秘潜在靶标的GO富集分析(A)和KEGG通路分析(B)
每个气泡图中气泡的大小代表了这个条目的基因数。从冷到暖的颜色表示从大到小的P值。每个气泡图都按P值排序。GO：基因本体论；KEGG：京都基因和基因组百科全书。(C)衰老和便秘的靶通路网络图。黄色标签和红色标签分别代表疾病靶标和信号通路。红色标签和绿色标签分别代表衰老和便秘之间的共同信号通路，以及衰老或便秘的特有疾病靶点。每个标签的大小代表其程度。蓝色节点和红色节点分别表示靶标路径
12.从疾病-靶标网络的角度分析衰老和便秘的相关性
为进一步分析衰老和便秘在分子机制上的相关性，作者基于衰老和便秘相关蛋白及其相应的重要信号通路，构建了关键靶标和主要通路网络(图7C)。该网络由171个节点组成，其中113个是蛋白质节点，58个是通路节点。在这些潜在通路中，癌症信号通路值最高，也最为重要，提示着癌症相关的信号通路是二者间最相关的信号通路。在这些潜在的靶标中，AKT1、MAPK1、PIK3CA、TP53、BRAF、mTOR、TNF和CCND1被确定为衰老和便秘中相关性较高的靶标，它们可能共同促进了衰老和便秘的发展。
讨论
便秘与衰老是密切相关的，但尚未有实验和机制的深入研究证明二者之间的相关性。本研究中，作者首先成功建立了衰老大鼠模型和便秘大鼠模型。然后，从宏观水平评估了衰老大鼠和便秘大鼠的运动能力，学习认知能力，胃肠蠕动能力。从微观水平，作者使用基于核磁共振(NMR)的代谢组学方法与主成分分析（PCA）及偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）等多变量数据分析方法相结合，分析了代谢产物与代谢途径中便秘与衰老之间的共同点。网络药理学也被用于寻找衰老和便秘的疾病靶标和通路，以进一步阐明衰老与便秘之间的联系。结果表明，衰老和便秘之间有许多共同点，包括但不限于行为，氧化应激，caspase-3蛋白表达，代谢产物，疾病靶标和代谢途径等。本文研究结果证明了衰老与便秘之间的相关性，并为衰老与便秘共有的临床症状、临床治疗和药物开发提供了参考。
1.衰老和便秘大鼠行为学表现异常的相关性
通常情况下，行为学表现是大脑控制的结果。因此，我们通过一系列行为学实验测试了衰老大鼠和便秘大鼠的学习记忆能力、排泄能力和自主神经活动，以直观地了解它们之间的潜在关系，并揭示相应的机制。
大鼠的学习和记忆能力是衡量大鼠中枢神经系统认知功能的一项重要指标，水迷宫实验被广泛用于大鼠的空间学习和记忆能力。在本研究中，衰老大鼠和便秘大鼠的空间和学习记忆都比对照大鼠差(图1)，表明衰老和便秘对中枢神经系统的功能产生不利影响。
胃排空率、胃肠墨汁推进率和胃肠转运时间等参数已被广泛用于检测泻药对便秘的影响。在此，我们同时测量了这些参数，以探讨衰老和便秘对大鼠胃肠运动的影响。衰老常常伴随着大量的器官衰弱，尤其是胃肠道和肾脏的功能衰退。老年人的尿量增加是一种普遍现象，这可能是肾脏疾病的早期症状。胃肠功能障碍和排便能力不足也是老年人便秘的主要原因。在本研究中，衰老和便秘大鼠的胃肠动力和排便能力均下降，表现为胃肠通过时间显著延长，胃肠排空率增加，肠推进率降低。已有文献报道老年人的胃蠕动和收缩能力也减弱，胃肌电活动紊乱也可能导致胃运动异常和胃排空障碍。综上，衰老引发的胃动力降低和胃排空减少可能是胃肌电活动紊乱所致。
用旷场实验测试大鼠自主运动能力。衰老大鼠和便秘大鼠穿越原站台的时间和总距离均显著高于对照组(表1), 表明衰老大鼠和便秘大鼠的活动能力显著降低。有文献报道，骨骼肌质量和肌力随着年龄的增长而下降，衰老大鼠的自主神经活动也会下降，而身体虚弱与胃肠道疾病呈正相关，例如胆囊病、结肠癌和便秘。在本研究中，衰老大鼠和便秘大鼠运动活动的减少也提示着它们胃肠功能的减弱。
Pearson相关分析表明，老年大鼠衰老指数（衡量认知能力）与便秘指数（衡量胃肠运动能力）呈显著正相关，表明便秘现象随年龄的增加而加重。站立次数与跨台次数呈显著正相关，说明随着年龄的增长，衰老和便秘大鼠的自主运动能力也降低。站立时间与胃排空率呈负相关，表明便秘的发生伴随着自主活动能力的下降。
便秘大鼠的不同行为间具有一定的相关性。而这种相关性在衰老大鼠中也能观察到。衰老大鼠和便秘大鼠在以上三种行为测试中均表现出共同的偏向和联系，有力地说明了衰老和便秘之间会有相互影响。
2.衰老和便秘之间氧化损伤的相关性
大量研究表明，氧化应激与许多疾病的发病和进展息息相关，例如神经退行性疾病、衰老等，是由机体过度的氧化应激引起的，氧化应激也会进一步影响中枢神经系统的功能。此外，便秘的发生、发展也与氧化应激密切相关。有研究表明，氧化应激会破坏肠道黏膜的机械屏障功能, 使肠道通透性显著增加。氧化氢酶是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一，在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是自由基清除剂，它们通过降低细胞内活性氧(ROS)水平，从而抵抗氧化应激损伤。脂质氧化的终产物丙二醛(MDA)，其含量可以反映机体脂质过氧化的程度，也是反应机体氧化损伤的间接指标。在本研究中，衰老大鼠和便秘大鼠血清SOD、CAT和GSH-Px水平均显著低于对照组，而MDA水平明显高于对照组。以上氧化应激指标的明显变化，表明衰老大鼠和便秘大鼠体内发生了明显的氧化应激。
3.衰老和便秘致细胞凋亡
细胞凋亡在个体的生长、发育和衰老等许多生理和病理过程中发挥着重要作用。细胞凋亡在生长、发育和衰老等许多生理和病理过程中发挥着重要作用。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，表达于凋亡细胞、凋亡小体等，海马CA3区被认为与学习记忆能力密切相关。在本研究中，衰老大鼠和便秘大鼠海马CA3区caspase-3的表达均显著高于对照组，表明衰老大鼠和便秘大鼠的海马组织发生了明显的细胞凋亡。引发细胞凋亡的因素很多，氧化应激是其中一个重要环节。有文献报道，衰老与线粒体中ROS水平升高有关，衰老的增加会激活细胞凋亡。结合氧化应激的实验结果(表2)，我们可以得出结论：衰老和便秘大鼠脑细胞死亡可能是由于自由基和抗氧化防御失衡所致。总体而言，细胞凋亡已被证明与氧化应激以及自由基和抗氧化防御之间的失衡有关。本研究进一步确证了细胞凋亡在衰老大鼠和便秘大鼠中均有发生，这可能是衰老和便秘之间具有相关性的重要机制之一。
4.衰老和便秘大鼠的代谢相关性
4.1与衰老相关的代谢变化
衰老的发生和进展都与细胞代谢变化有关，这可能为研究其发病机制提供了新颖的视角。对照组大鼠和衰老大鼠的食物摄入量没有差异，而粪便中氨基酸、食物分解产物和代谢物水平有明显的变化，因此这确实反映了与年龄相关的肠道微生物区系发生改变。
葡萄糖的消耗，乳酸的增加，而这两种代谢物呈负相关关系(图4A)，表明衰老对糖酵解呈依赖性增加。2-氧戊二酸、丙酮酸和柠檬酸水平的升高也验证了这一点，这表明维持身体生理活动所需的TCA循环的活性下降。此外，谷氨酸和丙氨酸也显著降低，与衰老大鼠的血糖水平呈正相关。谷氨酸被认为是增殖细胞产生能量的另一个重要来源，谷氨酸和丙酮酸在丙氨酸转氨酶的催化下发生转氨反应，生成丙氨酸和α-酮戊二酸，后者在有氧条件下进入三氯乙酸循环。因此，谷氨酸和丙氨酸水平的降低表明衰老发展过程中能量供应的减少。
与对照组相比，衰老大鼠粪便中亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸含量较高，这可能是由于衰老引起的上皮炎症和损伤导致吸收不良所致。已有文献报道，较高水平的天冬氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸与痴呆症相关，可能是因为衰老对大鼠大脑中神经递质的平衡产生了不利影响。
衰老大鼠肌酸水平的下降与能量传递过程的改变有关，可能是因为肌酸激酶活性的增加。在参与膜生物合成的过程中，胆碱在衰老过程中过度表达，并在细胞系中高度活化。因此，在粪便中观察到的胆碱水平的增加可能是由胆碱摄取的增加和衰老细胞的新陈代谢所致。
4.2 与便秘相关的代谢变化
便秘大鼠的粪便代谢谱提供了大量关于胃肠道代谢物状态的数据，这些数据包括环境因素、遗传和细胞生理过程。便秘相关代谢途径主要包括能量代谢、氨基酸代谢、胆碱代谢和短链脂肪酸代谢。
TCA循环的中间产物柠檬酸在便秘大鼠粪便中的含量低于正常大鼠，提示便秘对能量代谢有干扰作用。此外，在便秘大鼠中作为主要能量来源的葡萄糖含量的降低进一步支持了便秘时能量代谢的紊乱。有文献报道，牛磺酸通过增加便秘大鼠的胃肠动力从而促进排便，便秘大鼠粪便中牛磺酸水平降低，提示便秘大鼠胃肠动力不足。
有文献报道，粪便中胆碱的含量主要与膳食摄入量、小肠吸收以及肠道细菌转化为甲胺有关，甲胺气体的产生与结肠运输呈负相关。因此，推测便秘的发生可能会降低胆碱水平。
SCFAs，如醋酸和丁酸等，在便秘大鼠体内明显紊乱。这些单链脂肪酸通常是由肠道细菌通过碳水化合物的复杂发酵在结肠中产生的。丁酸易被肠上皮吸收，是保护肠上皮屏障的重要能源。丁酸在便秘大鼠体内的耗竭可能是由于其过度利用所致，这提示着便秘大鼠的SCFA代谢紊乱或肠道微生态环境被破坏。
4.3 衰老与便秘之间代谢变化的相关性
为了从微观角度阐明衰老和便秘之间的潜在相关性，我们总结了粪便代谢物和代谢途径的变化。衰老和便秘大鼠中有16种共有的代谢产物，除苯丙氨酸和脯氨酸外，其他代谢物的变化趋势类似。衰老和便秘大鼠中有9种共有的代谢途径，这些代谢途径主要参与能量代谢和氨基酸代谢。此外，共有代谢物和行为学的相关性分析也确证了实验结果的一致性。
本文的结果表明，衰老大鼠中会出现胃肠道功能紊乱、胃动力减弱的现象，便秘大鼠中也会出现学习和记忆能力和自主活动能力降低的现象。综上，我们发现衰老和便秘加速或促进彼此的过程。更糟糕的是，这种加速/促进可以带来严重的并发症，例如脑血栓形成，癌症等，从而对人体造成越来越严重的损害。
5.与衰老和便秘相关的疾病靶点和信号通路
GO富集分析表明，衰老和便秘大鼠的样品会在以下过程中富集，如胞浆、质膜和细胞外空间的酶结合、蛋白质结合和转录因子结合等。为了进一步探索衰老和便秘的疾病作用靶点，作者对候选关键靶点进行KEGG富集分析。图6显示了与衰老和便秘有关的前20条显著丰富的通路。
作者发现，癌症相关的信号通路是二者间最相关的信号通路。一方面，衰老与癌症密切相关，二者具有相同的生理机制，例如，老年人患各种癌症的几率比其他年龄段的人高。关于治疗，衰老相关的炎症细胞因子可以通过靶向特定的炎症介质来治疗癌症和衰老相关的疾病；另一方面，便秘是许多癌症的早期症状之一或癌症的伴随症状。因此，毫无疑问，癌症中的通路是衰老和便秘最相关的靶点。
前文中的KEGG通路富集得到了32条衰老和便秘共有的信号通路(图6)。癌症中的microRNAs，作为衰老和便秘之间常见的KEGG途径，已被发现与许多疾病和紊乱有关。
基于核磁共振(NMR)和微血管密度(MVD)分析的代谢组学已被广泛应用。但是，我们也发现工作中存在一些局限性。在方法学方面，我们可能需要其他分析方法，如LC-MS、GC-MS来验证实验结果。此外，由于大脑是退行性改变表现最明显的组织，在今后的工作中有必要对大脑进行深入的分析。此外，考虑到衰老和便秘之间的生理联系是多因素的，在今后的工作中，我们还将利用转录组和蛋白质组学技术，借助其高灵敏度和高定量准确性等技术优势，从基因和蛋白质水平上揭示衰老和便秘之间的相关性。
综上所述，本研究首次以衰老和便秘为例，运用系统生物学的两种方法，即粪便代谢组学和网络药理学，论证了这两种常见疾病之间的内在联系和相应的机制。从经典的行为学的宏观水平和免疫组织化学染色、氧化应激、代谢谱、粪便代谢产物、代谢途径和疾病靶标网络以及基因功能分析等微观水平揭示衰老与便秘发病机制的共同点。本研究结果不仅提高了人们对衰老和便秘发病机制的认识，也加深了对中医理论和现代西医理论的认识，也为衰老便秘的治疗方法和临床实践的发展提供了坚实的实验依据。
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