编译：Tigobin，编辑：十九、江舜尧。
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确定实体肿瘤的复杂成分是了解肿瘤发生、发展和转移的基础。虽然患者来源的样本提供了有价值的观点，但它们在多个分子水平上存在异质性，而且通常来自晚期肿瘤。本研究使用单细胞转录组和表位分析，结合途径和谱系分析，从发育角度研究涎腺鳞状细胞癌小鼠模型的肿瘤发生。研究者提供了一个完整的细胞图谱和肿瘤特异性细胞的特征。研究者发现，这些细胞沿着可复制的发育轨迹相连：起始于表现出上皮-间质转化特征的基底细胞，肿瘤发生经过Wnt分化的肿瘤干细胞样亚群，然后分化为管腔样细胞。研究者的工作提供了对整个组织环境中肿瘤特异性细胞特性的客观的见解，并强调了使用确定的遗传模型系统的优点。
论文ID
原名：Tracing tumorigenesis in a solid tumor model at single-cell resolution
译名：单细胞分辨率下追踪实体瘤模型中的肿瘤发生
期刊：NATURE COMMUNICATIONS
IF：11.878（2018影响因子）
发表时间：2020年
通讯作者：Samantha D. Praktiknjo
通讯作者单位：Berlin Institute for Medical Systems Biology
DOI号：doi.org/10.1038/s41467-020-14777-0
实验设计
研究者使用单细胞转录组和表位分析，结合途径和谱系分析，从发育角度研究涎腺鳞状细胞癌小鼠模型的肿瘤发生。其中具体实验方法包括：模型鼠的构建、组织分离和单细胞样品制备、Drop seq过程、单细胞和批量库生成以及排序、CITE-seq实验、免疫染色和单细胞RNA序列数据的处理与分析。
结果
1. 唾液腺肿瘤的单细胞RNA测序
为了识别和描绘实体肿瘤背景下特有的细胞异质性，研究者首先建立了可控的方法来将荷瘤(双突变体：β-catGOF；Bmpr1aLOF)和控制唾液腺分离成高质量的单细胞悬液(图1a)。总共，从12个对照和14个携带唾液腺种植瘤的小鼠中产生了26个单细胞RNA文库，这些小鼠有雌性或雄性，有早期和晚期，包括出生后第40天(P40)和第90天(P90) (图1a)。
图 1 综合唾液腺细胞图谱。a系统剖析实体瘤细胞多样性的实验策略。用流式细胞仪分离、分离颌下腺，分离单个活细胞。细胞立即固定在甲醇中，并通过高通量液滴为基础的单细胞方法进一步处理以描述其转录本。每个生物复制对应于来自对照或荷瘤的雌性或雄性小鼠的一个颌下腺的细胞，如所指示的那样处于限定的阶段。b蓝绿色-蓝色-绿色：管腔-腺泡-导管，粉红色：基底，紫色：肌上皮，棕色、黄色和橙色：非上皮性(免疫、内皮、成纤维细胞、T/NK)。c雌性颌下腺的解剖示意图基于单细胞转录组数据、现有文献(见参考文献)和免疫荧光在组织切片中的验证。
2. 全面的唾液腺细胞图谱
为了提供一个完整的唾液腺细胞图谱，也可以作为肿瘤背景的适当参考，研究者合并和用Seurat分析来自对照唾液腺的单细胞数据集(图1b)。在对标记基因进行检测后，研究者将细胞类型的同一性分配给簇，簇的特定基因的表达在以前的文献中已有报道，并且对没有或只有模糊信息的额外细胞类型进行了分子表征和验证（图1b，c）。
图2单细胞测序确定了不同的肿瘤干细胞样细胞和其他肿瘤特异性细胞群。a来自对照和双突变(β-catGOF；Bmpr1aLOF)荷瘤唾液腺的联合单细胞测序数据的聚类显示在tSNE中。肿瘤特异性上皮细胞簇以粉红色显示在tSNE的右下部：肿瘤干细胞、基底细胞、管腔内Clu+细胞。b相同的tSNE图显示了对照细胞和双突变细胞的相对局部密度。颜色梯度显示主要由双突变细胞(红色)、对照细胞(蓝色)或双重突变细胞和对照细胞(灰色)表示的群集。c Axin2、PTN、Wif1、Clu和Wfdc18在tSNE表达的肿瘤特异性上皮亚群中的表达，如从灰色(无表达)到栗色(高表达)的色标所示。
3. 肿瘤干细胞和其他肿瘤特异性细胞群的鉴定
为了系统地揭示肿瘤样本的特异性细胞，研究者分析并聚集了来自对照和双突变样本的所有单细胞数据集的细胞（图2a）。这种联合分析使研究者能够重述所有先前确定的细胞类型，而无需采用先进的样本比对方法，因为来自对照和双突变小鼠的细胞在tSNE上均匀分布，形成许多簇，如局部密度图（图2b）所示。特别是，研究者的分析揭示了肿瘤背景下具有独特转录谱的上皮细胞簇。这包括管腔样细胞和基底样细胞，以及一个小而独特的癌干细胞（CSC）样群体，其中Wnt特异基因被激活（图2b，c）。其中，一些基因如Axin2、Ptn、Wif1、Clu和Wfdc18的表达是这些肿瘤特异性细胞簇的特征（图2c）。为了进一步提高肿瘤特异性分辨率，研究者在可能的情况下加入了其他上皮标记物。根据研究者的转录组数据，Clu和Wfdc18在肿瘤区域内对K8阳性的管腔样细胞进行了特异性染色。因此，研究者将其作为一个额外的标记，发现核β-catenin阳性细胞通常为K8阴性，与高Axin2高度重叠，但仅部分与Ptn和Wif1染色重叠。总之，研究者鉴定了一小部分肿瘤特异性上皮细胞，并提供了一个标记集，可以在RNA和蛋白质水平上鉴定它们。
图3来自单细胞的mRNA和表位组合分析解决了肿瘤微环境中免疫细胞的多样性。a通过测序(CITE-SEQ)实验对转录本和表位进行细胞索引的概述(n=4)。如前所述制备单个活细胞。63个寡核苷酸偶联抗体库与一个颌下腺的细胞悬液孵育，洗涤后通过Drop-Seq进一步处理。寡核苷酸包含抗体特异性条形码、PCR手柄，并被多聚腺苷化，以便被Drop-Seq引物捕获。b所有单细胞数据集的基于mRNA的聚类。来自CITE-seq实验的细胞被突出显示(不透明的颜色)，而不是来自先前的'Drop-Seq only’转录组数据集的细胞(半透明颜色)。c CITE-seq实验中选定的免疫特异性标记物的表位和mRNA信号。d免疫群集的亚群(如b所示)识别4个巨噬细胞亚群。e对照或双突变样本的细胞对免疫亚群的贡献。
4. mRNA和细胞表面蛋白的同时定量可以解决免疫细胞的多样性
无偏转录谱鉴定出四组不同的适应性和先天性免疫细胞。T或NK细胞（“T/NK”；Ccl5、Nkg7、Cd7）和组织内的单核吞噬细胞（“免疫”）已经存在于对照唾液腺中（图1b）。在肿瘤背景下，与对照组相比，双突变体中的“免疫”细胞明显更丰富。此外，在双突变组织中出现了新的单核细胞群（'免疫2’）和终末分化的B浆细胞（'产生免疫球蛋白’；Ly6c2、Slpi、Xbp1），显示免疫细胞在肿瘤环境中的流入或激活（图2a）。为了更详细地研究这种肿瘤特异性免疫室，研究者将'CITE-seq’与63种主要针对免疫和一些上皮细胞表面蛋白的寡核苷酸偶联抗体结合使用。这使得研究者能够同时量化来自新近分离的~P70对照和含肿瘤唾液腺的单个细胞的mRNA转录物和蛋白质表位（图3a）。CITE-seq的实现没有引入任何明显的转录偏倚，因为基于mRNA的聚类与研究者先前获得的转录组数据集概括了来自CITE-seq实验的细胞在tSNE中均匀分布的所有细胞簇（图3b）。细胞表面蛋白信息的整合增强了诸如CD172a和CD11b等特定标记的信号（图3c），证实“免疫”和“免疫2”簇主要由来自单核细胞系的髓细胞组成。组合“免疫”簇的亚群聚显示了四个细胞亚群，它们显示了具有不同激活和功能状态的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的特征（图3d，e）。总之，研究者的研究结果表明，Wnt依赖性涎腺肿瘤模型中的免疫景观以髓细胞和TAMs为主，并伴有少量肿瘤相关B浆细胞。与这些肿瘤的侵袭性特征一致，炎性T细胞的浸润似乎较低，T/NK主要与组织常驻细胞相对应。
图4亚群显示肿瘤干细胞样细胞和基底细胞的额外异质性。a肿瘤特异性上皮亚群的亚聚类鉴定了两个癌症干细胞样('CSC1'和'CSC2')和两个基底细胞('基底正常'和'基底肿瘤')亚群。b多个基因在亚聚集肿瘤特异性tSNE表达中的表达，以从灰色（无表达）到深蓝色（高表达）的色阶表示，高表达区域突出。c CSC样和基底亚群差异表达基因的基因集富集分析。
5. 亚聚类揭示了肿瘤干细胞和基底细胞的两个亚群
由于研究者的数据表明肿瘤特异性细胞内存在异质性（图2b，c），研究者选择基底细胞和类CSC细胞进行亚聚集（图4a），这表明两个簇中的每一个都包含两个不同的亚群。对顶端标记基因（图4b）的检测表明，CSC 1亚群表现出更多的基底样（K14+/K5+）Wnt-high（Bmp2，Bmp4，Dkk4+），而CSC 2则表现出更明显的亮度样（K18+）特征。此外，研究者能够区分肿瘤特异性基底细胞亚群（“基底肿瘤”）和“正常”基底细胞亚群（“基底正常”），通过将亚聚集细胞群从所有样本的聚集投影回原始tSNE坐标来说明这一点。为了从功能上描述这些差异，研究者在相应的CSC样和基底亚群之间进行了差异表达和随后的通路分析（图4c）。这证实了研究者在CSC样细胞中的初步观察，与Wnt/β-catenin信号和基底细胞癌相关的结合端在“CSC 1”中比“CSC 2”亚群中富集最显著。在比较两个基底亚群时，研究者发现主要的系统差异与细胞外基质（ECM）蛋白或上皮-间质转化（EMT）信号有关，在肿瘤特异性基底亚群中，EMT信号明显上调。具体来说，研究者观察到EMT主调节因子Snai2的上调超过两倍，其他特征基因如Serpine2、Sparc、Acta2、S100a6或TGF-β调节因子Bgn（图4c）的强诱导，而许多其他典型的EMT标记如Zeb1/2、Twist1/2、Fn1或Cdh2在研究者的数据中检测不足，无法进行差异表达的检测。
图5计算谱系模型能够可靠地推断肿瘤形成的轨迹。a肿瘤特异性上皮细胞群体的扩散图，以及通过在伪时间内平滑扩散坐标而获得的推断轨迹。b不同亚群细胞沿伪时间的密度图。c标准化EMT、Wnt和茎度路径得分，使用LOESS回归在伪时间内平滑。d 4个亚群中≥5个细胞的双突变体P40和P90样本的细胞密度图沿伪时间方向。e同一样本按阶段划分的亚群比例。f 4个亚群之间的前100个差异基因的SAVER输入基因表达热图（前16个突出显示）。
6. 计算谱系分析重建肿瘤发生
研究者进一步研究了肿瘤特异性细胞在多大程度上相互联系，并在研究者的遗传模型中对肿瘤的发生做出了贡献。研究者选择了扩散图方法，它将数据嵌入到低维空间中，在低维空间中，细胞之间的距离表示渐进但随机的连续，例如在发育过程中。结合伪时序，这一分析使研究者能够预测肿瘤发生的分化轨迹(图5a)。与研究者的模型一致，在研究者的模型中，通过碱基特异的K14-cre启动子激活β-catenin和Bmpr1a突变而诱导肿瘤，研究者发现这一轨迹起始于基底肿瘤细胞，进一步穿过两个类似CSC的亚群，并以腔内Clu+细胞簇为终点，其间有连续的过渡(图5a，b)。为了验证这一轨迹，研究者利用不同的时间点(P40和P90)收集样本，并监测按分期(图5d)而不是按细胞类型汇集的肿瘤特异性细胞的贡献。与研究者的模型一致，研究者发现在肿瘤形成的初期，来自P40早期的细胞数量比来自P90晚期的细胞数量显著增加，而在更高级的阶段，相反的情况是成立的，而在肿瘤形成的初期，P40肿瘤早期的细胞数量比P90晚期的细胞数量显著增加，而在更高的阶段，P40的细胞数量则相反。肿瘤特异性细胞的分期定量表明，尽管两个CSC样细胞的相对比例相似，但实际上，P40细胞中的基础肿瘤和腔内Clu+细胞分别比P90细胞中的丰富程度显著增加和显著减少(图5e)。为了研究全局表达动力学沿轨迹的潜在变化，研究者取了四个亚群之间差异最大的基因，并且按伪时序排列它们的表达（图5f）。结果复制了图4c中总结的差异表达分析，并且表明研究者可以另外捕捉到单个基因的更细微的差异，对于这些差异，表达随着肿瘤进展而改变。研究者发现，EMT相关基因如Ctgf和Sparc首先在基底肿瘤细胞中被激活，并且随着肿瘤的发生，它们的表达在细胞群（Ctgf）中或在两个CSClike亚群（Sparc）中扩展和减少（图5f）。最后，Clu和Wfdc18，研究者确定是腔Clu+细胞特有的(图2)，在研究者推测的轨迹的后期阶段表达。验证了先前提出的EMT、Wnt信号和茎性之间的关联，研究者发现EMT表达特征的逐渐丧失与Wnt信号的激活和已知的CSC标记基因在头颈部鳞状细胞癌中的诱导有关(图5c)。总之，研究者的结果表明，研究者的方法可以识别潜在调节和驱动肿瘤发生的特定基因和表达模式。
结论
在这项研究中，研究者创建了一个高分辨率的唾液腺细胞图谱，并系统地解剖了实体瘤的遗传控制的、Wnt依赖的小鼠模型中的细胞异质性。在这项研究中，研究者创建了一个高分辨率的唾液腺细胞图谱，并系统地解剖了实体瘤的遗传控制的、Wnt依赖的小鼠模型中的细胞异质性。研究者鉴定了肿瘤特异性细胞簇的分子特征，并通过揭示CSCs的祖细胞和子代群体建立了它们的谱系关系。
评论
研究者的工作证明了使用受控模型来可靠和重复性地研究癌症发生和肿瘤进展的基本机制的重要性，否则这是不可能的。最后，研究者的方法提供了一个蓝图来从分子上识别标记和表征转录事件，这些转录事件在肿瘤发生的调控中是基本的，并最终在设计适当的治疗策略方面促进进一步的临床研究。
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