编译：Sophie，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Small RNAs With a Big Impact on Horticultural Traits
译名：对园艺性状有重大影响的小RNAs
期刊：Critical Reviews in Plant Sciences
IF：4.189
发表时间：2020.03
通讯作者：殷学仁
通讯作者单位：浙江大学农业与生物技术学院园艺系，浙江省园艺植物综合生物学重点实验室
DOI号：10.1080/07352689.2020.1741923
主要内容
1 小RNAs的生物起源
A. microRNA的生物起源
microRNA（miRNA）是一类具有生物起源的小RNA，在植物中被广泛研究并大多保守（图1a）。miRNA是由MicroRNA（MIR）基因产生的。Pol II（RNA聚合酶II）将MIR基因转录成含有典型茎环结构的初始miRNAs（pri-miRNAs）。这些pri-miRNAs被DCL1（DICER-LIKE 1，RNaseⅢ家族内切酶）裂解，产生前体miRNAs（pre-miRNAs）。随后，DCL1再次裂解pre-miRNAs产生miRNA/miRNA*双链。两个裂解修饰步骤都发生在细胞核中。在动物系统中，pre-miRNAs通过Drosha（RNase III酶）在细胞核中产生pre-miRNAs。然后，这些pre-miRNAs被运输到细胞质中，通过Dicer（Rnase III酶）产生miRNA/ miRNA*双链。在植物中，miRNA/ miRNA*双链的3’末端被HUA ENHANCER1（HEN1）2-O-甲基化，然后由HASTY（HST）甲基化双链从细胞核运输到细胞质中。最后miRNA/ miRNA*双链在细胞质中解开，miRNA*迅速降解，而成熟的miRNAs被整合到AGO1蛋白（ARGONAUTE 1）中形成一个激活状态的RNA诱导沉默复合物（RISC）。基于pre-miRNAs中典型的茎环结构，研究人员开发了多种软件程序（表1）来预测植物pre-miRNAs和成熟miRNAs。一般来说，pre-miRNAs和成熟miRNAs是通过结合参考基因组和小RNA测序数据来预测的（表1）。大多数miRNA信息都是在miRbase V23中收集的，其中包含植物miRNAs和动物miRNAs。最近，建立了一个名为PmiREN（植物MicroRNA百科全书）的植物特异性miRNA数据库，其中包含88种植物的miRNA信息和16000多个预测miRNA位点（http://www.pmiren.com/）。
图1 miRNAs和siRNAs的生物起源。（a） miRNAs和phasiRNAs的生物起源。（b） 24 nt的siRNAs的生物起源。Pol II：RNA聚合酶II；DCL：DICER-LIKE；HEN：HUA ENHANCER1；HST：HASTY；RDR：RNA依赖性RNA聚合酶；SGS：基因沉默抑制因子。
表1 小RNA预测和靶基因预测软件。
B.植物中phasiRNA的生物起源
phasiRNAs是一类独特的小RNA，仅存在于植物中（图1a）。PhasiRNAs由PHAS基因产生，miRNAs切割初始PHAS转录物，触发phasiRNAs的产生。尽管phasiRNAs的产生依赖于miRNAs，但它们的功能与miRNAs相似。根据靶向基因的方式（反式，tasiRNAs；顺式，casiRNAs），这些基因被分为tasiRNAs或casiRNAs。第一组特征性PHAS基因命名为TAS1-4（反式作用siRNA），由于phasiRNAs的反式功能，它们（TAS1-4）都是非蛋白编码基因。但是，一些蛋白质编码转录本也是潜在的PHAS转录本，并且编码MYBs。
根据miRNA靶点的数量，产生有两种模式的phasiRNAs，分别称为一类和二类。对于一类模式，原始PHAS转录本被22 nt的miRNA切割，下游片段被RDR6（RNA依赖性RNA聚合酶6）和SGS3互补成双链RNA（dsRNAs）。这些dsRNAs被DCL3b或DCL4裂解产生连续的正、反phasiRNAs（DCL3b和DCL4分别产生24 nt和21 nt phasiRNAs）。对于二类模式，原始PHAS转录本被两个21或22 nt的miRNAs在不同区域切割（如TAS3），但只有3’靶位点被切割。与一类模式相比，上游片段被RDR6和SGS3互补成dsRNAs，然后dsRNAs被DCL4从3’到5’切割成连续的正、反21 nt phasiRNAs。产生的原始phasiRNAs也被HEN1 2-O-甲基化。最后，甲基化的phasiRNAs被整合到RISC中，这些成熟的phasiRNAs具有与miRNAs相同的功能。由于生成的phasiRNAs是从原始PHAS转录本中连续产生的，因此创建了预测PHAS转录本和phasiRNAs的软件（如sRNAworkbench；表1）。
C.植物中24 nt siRNA的生物起源
24 nt siRNAs在植物中广泛存在，并指导从头DNA甲基化（图1b），这种甲基化在植物中广泛存在。24 nt siRNAs通常是从靶位点转录的。首先，Pol VI从靶位点转录单链RNAs（ssRNAs）。在拟南芥中，Pol IV控制了超过90%的24 nt siRNAs的产生。随后，RDR2将ssRNAs转化为dsRNAs，DLC3将dsRNAs裂解为24 nt的siRNAs。这些24 nt的siRNAs被HEN1进一步甲基化。最后，24 nt siRNAs与scaffold RNAs结合形成复合物，并与RNA定向DNA甲基化（RdDM）途径结合。
2 小RNAs的功能
A.转录后调控
大多数转录后调控是通过预先形成的miRNAs和phasiRNAs的基因沉默实现的。miRNAs或phasiRNAs与AGO1（ARGONAUTE1）或AGO1/7（ARGONAUTE1/7）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。RISC通过小RNAs与靶基因的碱基互补来区分靶基因。RISC系统有两种作用模式：转录裂解和翻译抑制（图2a）。转录抑制通常被认为发生在低碱基互补水平，而转录裂解需要高碱基互补水平。在植物中，翻译抑制比转录裂解少。同时，大多数靶位点位于CDS区域，这与靶位点通常位于3’ UTR、翻译抑制比转录裂解更频繁的动物系统不同。在转录裂解模式中，靶基因被RISC切割成两个片段。5’片段能被核苷酸转移酶聚腺苷酸化，然后细胞质外体迅速降解聚腺苷酸化的5’片段。相反，由于这种特殊的现象，3’片段可以保持更长的时间，因此开发了degradome测序法来检测植物组织中小RNA切割mRNA。
图2 miRNAs和siRNAs的功能。（a） 转录后调控。（b） 从头DNA甲基化。
B. RNA定向的DNA甲基化
RNA定向的DNA甲基化是植物主要的表观遗传途径（图2b），通常在病原防御、非生物胁迫和植物发育过程中观察到。首先，24 nt siRNA与AGO4结合，然后siRNA-AGO4复合物被转运到细胞核中。24 nt siRNAs能区分初始的scaffold转录本（被Pol V从基因间非编码区转录的）并通过碱基互补与之结合。复合物招募DNA甲基转移酶介导从头甲基化。在植物中，RNA定向的DNA甲基化区域通常发生在基因组CG、CHG和CHH位点。最后，这些DNA甲基化的变化改变了基因的转录水平。
3 模式植物和园艺植物中保守的小RNA特征
大多数小RNA研究都集中在模式植物如拟南芥和关键经济作物上（如水稻和小麦）。目前已有研究旨在解释小RNAs与园艺性状之间的关系。对几种园艺植物的基因组进行了测序，并成功地鉴定出小RNAs，包括肉质果（苹果、柑橘、香蕉、梨、柿子等）、蔬菜（番茄、大白菜）和鲜花（菊花）。一些小RNAs在高等植物中被认为是保守的，因为它们在不同的植物中具有相同或相似的序列。其中包括miR156、miR162、miR164、miR166和miR172，它们不仅在模式植物（如拟南芥、水稻）中被识别出，而且在园艺植物如苹果、梨、猕猴桃中也被识别出（数据来自miRbase和PmiREN）。一些miRNAs只存在于植物物种的一个子集中，例如miR528只在单子叶植物中检测到。每个物种通常都有特异性的非保守miRNAs，在其他的物种中没有发现的。这种miRNA相关的信息已经在miRbase和PmiREN中收集到了。至于PHAS产生的phasiRNAs，被miR173触发的TAS1和TAS2似乎只在拟南芥中被发现。但是，TAS3同源基因在很多植物中也被发现，在一些植物中也发现了TAS4同源基因。miR390切割TAS3产生ARF-tasiRNAs，miR828切割TAS4产生MYB-tasiRNAs。其他一些PHAS基因是植物特有的，如柑橘的miR3954触发Cs1g09635产生phasiRNAs。
miRNAs和tasiRNAs的许多靶基因是TFs，如miR156调节SPL TFs（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE），miR164介导NAC TFs（NAM，ATAF和CUC），miR172调节AP2/ERF TFs，ARF-tasiRNA影响植物ARFs。此外，保守的小RNAs的靶基因在不同植物中也表现出相似的功能，如在拟南芥、水稻、猕猴桃中。花的发育受到miR172控制的AP2 TFs的严重影响。而且，SPL TFs（miR156的靶位点）与拟南芥和多年生乔木的生长期变化和毛状体发育有关，番茄中也检测到这种表型。miR397切割LAC表达介导植物木质素生物合成。至于phasiRNAs，miR390触发TAS3产生ARF-tasiRNAs，并且靶向参与花和果实发育的ARF TFs。TAS4被miR828激活产生MYB-tasiRNAs（主要切割MYB TFs）。特定的MYB TFs调节苯丙酸途径和其他园艺特性，如色素沉着、风味和质地。保守的小RNAs和非保守的小RNAs在园艺作物中的作用可能导致特定的园艺性状。综述了小RNAs对园艺性状影响的研究现状（表2）。
表2 小RNAs及其在园艺性状中的作用。
A.成长期变化和花发育
花作为植物的重要器官，也代表着植物从营养生长到生殖生长的阶段性转变。对于果树，花当然是结果收获所必需的的。在花器官形成之前，植物需要经历幼年期，幼年期的长度因物种而异。对于蔬菜来说，大多数是种子发芽到开花不到一年的一年生作物。幼年期对果树栽培尤为重要，因为大多数肉质果都是多年生树种，需要较长的幼年期，如桃树需要3年能结出果实，而柑桔树则有5年以上的幼年期。幼年期长是育种和商业化栽培的难题。因此，它往往是减少青少年期的一个目标。目前，嫁接是一种有效的减少幼年期的方法。了解其内在的分子机制，将有助于今后的育种和栽培。
花的发育也是一个关键问题，因为花的形状和颜色对观赏花的价值有很大的影响。miR172是花发育所必需的miRNA，因为miR172的大多数靶基因是AP2 TFs，通过负调控FT（FLOWERING LOCUS T）基因参与植物花发育。miR156是另一个关键的成长期变化的miRNA。miR156的靶基因是SPL TFs。在拟南芥中，11个SPL成员被miR156调控。在11个潜在靶基因中，SPL3/4/5已被证实为miR156靶基因。在拟南芥中过表达miR156推迟了开花时间，而过表达SPL3/4/5提前了开花。进一步的实验表明，SPL3/4/5蛋白直接结合FD-FT复合物，激活开花相关基因，从而促进早花。SPL9和SPL10也是miR156的靶基因。SPL9和SPL10可以与MIR172b的启动子特异性结合，导致miR172的积累，从而通过miR172-TOE-TF途径调节开花时间。因此，miR156-SPL-miR172-AP2-FT途径对植物开花具有重要意义。
在园艺植物中，miR156和miR172也参与了开花时间的调控。在拟南芥中过表达苹果MdmiR156h降低了内源SPL9和SPL15的表达，延长了幼年期，导致后开花。在拟南芥中过表达苹果MdmiR172e导致了早花表型。一些物种特有的小RNAs也能调节开花时间。如柑橘miR3954是一种柑橘特异性miRNA，它以NAC TF和两个长的非编码基因为靶点。miR3954触发lncRNAs产生phasiRNAs，从而切割多个miR3954靶向NAC TFs。当miR3954在柑橘中过表达时，会导致柑桔的早花。
小RNAs在花器官结构中也起着重要作用。在桃中，高分辨率连锁图谱发现AP2 TF（Prupe.6G242400）对单花和双花性状至关重要。进一步的研究表明，在AP2 TF中的miR172靶位点缺失导致了双花性状。NAC TFs、CUC1和CUC2是花结构发育的重要基因，受miR164调控。过表达MIR164c下调CUC1和CUC2的表达，导致萼片融合和花瓣缺失。在柿子中，转录组学和进化方法揭示了一种雄性Y-特异非保守性的miRNA-OGI。OGI靶向一个常染色体MeGI基因（调节花药育性的同源结构域TF）。当过表达OGI时，拟南芥的花可以雌性化。
B.果实发育
果实大小和形状是肉质果的重要育种目标。果实大小不仅决定着收获产量，而且影响着消费者的决策。据报道，miR172在果实大小中起着重要作用，但对不同植物的果实大小有不同的影响。miR172靶向AP2 TFs，影响卵巢和果实发育所需的AG（AGAMOUS）和FUL（FRUITFUL）表达。相反，当miR172e在苹果中过表达时，果实大小会严重减少，但其机制仍不清楚。进一步研究表明，miR172根据果实类型影响果实大小。在番茄中过表达miR172，转基因番茄果实的大小比野生植物减少4-5倍。此外，在拟南芥中过表达苹果miR156导致果实比野生植物短。miR156可能通过miR156-SPL-miR172-AP2途径影响果实的生长。同样，在番茄中过表达Sly-miR156a可使果实大小和产量减少2倍。
生长素是器官发育的必需激素。在水果中，生长素影响形状和发育。ARFs（Auxin response factors）是一类在生长素信号转导中起重要作用的TF，miR160、miR167和ARF-tasiRNA参与调控。ARF8（miR167的靶基因）负调控拟南芥果实的形成（Goetz等人，2006），过表达SlyARF10（miR160的靶基因）诱导番茄形成梨形果实。过表达ARF2（源于TAS3的ARF-tasiRNAs的靶基因）也会导致番茄形成梨形果实。
果实成熟是果实发育的最后阶段，也是决定货架期的关键因素。在番茄中，TFs控制成熟，如Nr（永不成熟），Nor（不成熟），Cnr（无色不成熟），Rin（成熟抑制剂）和SlAP2a（APETALA2a）。有些TFs是由小RNAs调控的。CNR（一种SPL）被miR156或miR157切割，在CNR突变体中发现了mRNA切割特征。此外，SlAP2a是miR172的靶基因，AP2a是番茄成熟的负调控因子，AP2a RNAi果实表现出早熟现象（果实产生的乙烯比野生型多）。因此，miR172也是水果成熟的一个潜在的重要miRNA。
近年来，miR164通过NAC TFs调控猕猴桃果实成熟。NACs通过激活AdACS1和AdACO1的表达调节果实成熟。研究表明，miR164-NAC途径调控不同种类肉质果实的成熟。其他特定的小RNAs也参与果实成熟。番茄miR1917通过切割CTR4剪接变异体介导番茄乙烯反应，而过表达miR1917通过增强乙烯反应诱导番茄果实早熟。DNA甲基化也是果实成熟的一个调节因素，24 nt小RNAs也被发现通过调节DNA甲基化（RdDM）在肉质果成熟过程中发挥重要作用。进一步的研究表明，DNA低甲基化是由成熟过程中DNA脱甲基酶的增加引起的。但是草莓DNA低甲基化并非由DNA去甲基化酶引起，而是与RdDM途径有关。草莓中24 nt siRNA的减少导致DNA低甲基化。
果实品质包括质地、颜色、香气和含糖量。NAC TFs是果实中的多功能基因，miR164-NAC不仅影响猕猴桃的乙烯产生，还调节香气产生（通过萜烯合成酶基因AaTPS1的活性）和半纤维素（AdMAN1）的降解。而且，miR397是木质素生物合成相关的miRNA，其靶基因是参与木质素聚合的漆酶家族基因。瞬时过量达Pbr-miR397a可降低梨果实LAC基因表达和木质素含量。在烟草中稳定过表达Pbr-miR397a降低了烟草内源LAC基因的表达和木质素含量。
花青素是一种被广泛识别和研究的植物色素，在包括葡萄、草莓、蓝莓等园艺作物的不同植物中产生红色、紫色和蓝色。花青素是类黄酮化合物，MYB TFs负责调节木质素和类黄酮化合物的生物合成途径。miR828和miR858 miRNAs，主要靶向MYB TFs。miR858能够直接切割MYB转录本，而miR828可以切割MYB TF mRNA，也可以触发TAS4产生MYB-tasiRNAs来切割它们。miR828和miR858介导MYB114来调节葡萄花色苷生物合成。
C.生物和非生物胁迫
植物生物胁迫发生在病原菌侵染过程中。植物有一系列的免疫反应，以保护自己免受病原体的侵害，确保健康生长。R基因（抗病基因）在植物被感染时提高抗病性。NB-LRRs是R基因中最大的一类，包含NB和LRR结构域。小RNAs靶向预测表明miR482/2118靶向NB-LRRs来介导植物抗病性。miR482b通过切割NBS-LRR基因来调控番茄疫霉抗性，过表达miR482b植株比野生植株更易患疫霉，而下调miR482b则对疫霉有更强的抗性。小RNA（siR277）可能与苹果叶斑病抗性有关。siR277靶向五个控制叶斑病抗性的NB-NRR基因。而且，miR164还通过介导NAC4在拟南芥中的表达，在控制病原菌诱导的细胞死亡率中发挥作用。
提高非生物胁迫抗性对栽培园艺植物也是至关重要的。据报道，miR164、miR319、miR393、miR398和miR399与非生物胁迫有关。在水稻中，6个NAC TFs（OMTN1-6）是miR164的靶基因。在水稻中过表达OMTN2/3/4/6降低了抗旱性。相反，miR319是与低温相关的miRNA，在甘蔗中在4℃下其表达下调。miR319可能通过TCP-PCF6和GAMYB调节低温抗性。miR398是拟南芥中与高温相关的miRNA。miR398靶基因包括铜/锌超氧化物歧化酶。拟南芥中过表达miR398增强了转基因植物的耐热性，而过表达其靶基因降低了耐热性。RdDM途径也参与了基础耐热性；拟南芥nrpd1突变体（参与24 nt siRNAs生物起源的基因）在热处理后表现出低存活率。
D.通过小RNAs实现靶向园艺性状的平衡，为未来园艺提供参考
小RNAs在植物发育、植物响应和生物/非生物胁迫耐受性中起着至关重要的作用（图3）。而且，一个小RNA可以影响多种组织的发育，如miR156、miR167和miR172不仅影响花的发育，而且影响果实的品质。此外，一些小RNAs是作物性状的基础，这些性状是改良的目标，如miR396在番茄中过表达会产生更大的果实和花朵。但是，一个性状的改善可能会减少其他特性，如过表达miR156会减短幼年期并提高花青素含量，也会增加毛状体的数量。因此，我们必须考虑小RNAs介导的目标园艺性状的平衡。
图3 miRNAs和siRNAs在不同发育阶段的作用。
控制小RNA表达的组织或时间可能是至关重要的。miR397的上调降低了果实中的木质素含量，但木质素的减少可能严重影响茎的发育。不同的园艺性状可能受到不同小RNA家族成员的影响，如miR164a/b对生物和非生物胁迫有积极影响，而miR164c可以减少拟南芥的花瓣数量。相同小分子RNAs在特定植物中可能具有不同的功能。如，miR172可以减小苹果果实的大小，但miR172可以增大拟南芥果实大小。
园艺植物中小RNAs的未来研究很可能集中在miR156、miR164和miR172上，尽管它们已经在拟南芥中得到了广泛的研究。如，与拟南芥相比，miR156在苹果果皮花色素苷生物合成中具有相反的功能。miR528是一种单子叶特异性的microRNA，对开花和抗病毒有很强的影响。miR166、miR394和其他研究较少的miRNAs，通过生物信息学鉴定目标，可能在园艺植物中提供意想不到的收获。特别重要的是，不要忽视物种特异性miRNAs，它们可能是园艺植物不同性状的原因。对于其他小的RNAs，尽管TAS3和TAS4在不同的植物物种中很常见，但是其他物种特异的PHAS基因可能通过非保守的phasiRNAs影响特定的性状。
结论
自从小分子RNAs被发现以来，这些分子的生物起源和功能就受到了广泛的研究。功能包括siRNA诱导的DNA甲基化。小RNA测序和小RNA预测软件（主要用于miRNAs和phasiRNAs）已经被开发出来，用于改进非模式物种中新的小RNA鉴定。利用degradome测序和靶基因预测软件，阐明了小RNAs在园艺植物中的作用。早期在园艺方面已经取得了一些研究，如miR156减少了幼年期，以促进果树的栽培和育种。此外，园艺植物似乎具有丰富的特异性非保守RNAs，它们可能具有多种功能。但是，园艺植物小RNA的研究还处于初级阶段。在特定作物中，小RNAs的过表达或沉默是决定特定功能的必要条件，这可能受到转化系统的可用性和长幼年期的限制。
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