编译：夕夕，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：A Comprehensive Integrated Anatomical and Molecular Atlas of Rat Intrinsic Cardiac Nervous System
期刊：iScience
IF: 新刊暂无
发表时间：2020.5
通讯作者：James S. Schwaber
通讯作者单位: Daniel Baugh Institute for Functional Genomics/Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA, USA
DOI号：https://doi.org/10.1016/ j.isci.2020.101140
结果
1. 数据采集流程的多学科方法
作者在大鼠心脏的3D结构内创建完整的解剖图和分子轮廓。作者结合了多种技术以收集数据。这些数据采集方法在图1的两个流程中以图形方式表示。在图1A所示的流程中，作者使用刀口扫描显微镜（KESM）成像并保留了心脏的3D结构。使用组织映射器对用于在整个心脏的组织学环境中映射ICN的结果图像进行注释。
第二个流程显示了心脏的低温恒温器切片后使用转录谱分析确定神经连通性和分子表型后，以单细胞规模样品的形式获取神经元的情况（图1B）。然后可以将这些神经元的分子表型置于整个心脏和ICN解剖环境中。这些部分的图像使用Tissue Maker进行比对，以创建具有神经元表型数据的整个心脏系统。
2. 大鼠心脏的全面神经解剖学
使用第四代KESM平台切割心脏组织切片并成像，保留组织切片的切片形态。图像分辨率可清晰显示细胞/神经元规模的组织学图像。 所有切片图像的记录和堆叠均采用与专用软件TissueMaker和Tissue Mapper兼容的格式，Tissue Mapper可以精确秒回每个组织切片中每个神经元的位置以及心脏和血管的组织学特征。然后，作者使用计算机图形技术将所有神经元的位置和心脏组织的特征结合起来，以将所有数据作为心脏组织学中特定心脏的ICN分布的精确3D表示。由于组织图像采集以及神经元和心脏特征的映射都在亚微米分辨率下进行，因此此结果是精确且可重现的。此数据采集流程如图1A所示。可通过SPARC数据库在线获取完整的解剖学映射数据集。
作者试图通过在心脏背景下使用ICN的3D图形模型以及通过旋转模型来描绘心脏上神经元的分布，范围和位置。检查ICN的3D模型框架，显示整个神经元紧凑且位于左右心房上下左右的区域，并向下延伸至房室边界或冠状动脉沟与心室的边界（图2A）。图2B–2F，是心脏某些区域的放大图像，以突出显示ICN的解剖特征，其中每个轮廓勾勒出心脏解剖的特定特征，这些轮廓被调暗。 这样可以更好地了解与特定心脏结构相关的ICN分布，形状，程度和位置。在所有轮廓都被照亮的情况下，放大后的ICN似乎包含三个或更多的大型簇，其中神经元几乎连续地将延髓延伸到尾端（图2B）。在其最大范围内，ICN的部分位于心脏右侧，位于肺动脉和上腔静脉的附近（图2C）。当神经元延伸到这些水平以下时，它们以“逗号”的形状分布，并向左横向延伸。 这些水平的神经元位于心房和房间隔内。总的来说，如图2F所示，3D重建说明了最突出的神经元簇如何位于左心房和/或跨两个心房。
图2 雄性大鼠心脏三维重建后视图
ICN分布于后心房。为了以更高分辨率定位与心脏后结构相关的神经元，作者使用来自组织Mapper软件的虚拟切片“部分投影”工具。使用该工具，作者制作了一个虚拟切片，仅显示3毫米矢状面上、下、心后表面中心的神经元，如图3所示。这显示了心脏结构更受限制的部分，同时提供了比单一切片更连贯的视图。在这一水平上，大部分神经元似乎低于心脏底部，并延伸至冠状沟。这个切片和视图集中在心脏的后表面。这种方法的优点是比单一切片提供了更广泛的背景，也比全3D心脏背景提供了更集中的观察。在图3中，ICN的部分投影显示了密集的神经元簇，其上、下方向分布在心房和脑主动脉，但优先分布在左心房。
通过旋转三维模型，作者发现一个更好的视图，该视图能够区分与右心房相关的神经元和左心房相关的神经元（图4A）。可以观察到左右心房神经元的分布与IAS相关，神经元与两个心房相关，但更多的是左心房，在IAS本身的数量更少。在图4A中，可以观察到左右心房神经元的完整分布。
在图4B中，作者的目标是获取并仅可视化位于心脏基部的神经元。同样使用“部分投影”，用户定义的3D心脏模型子集和任意平面和厚度的神经元都可以被显示，多于单个部分，少于完整的3D模型。使用部分程序工具，作者制作了一个虚拟切片，只显示心脏底部的神经元(图4B)。这些ICN神经元在基底部的心外膜上与心门的主要肺血管相连。这些神经元似乎在右心房和IAS中。
图3 ICN在心脏矢状切面部分投影中的分布
图4 ICN可视图
作者的结果显示，大多数神经元位于较低的心脏底部，向尾部延伸至与心室的边界，如图2和图3所示。图5显示ICN神经元横向和纵向显示3毫米厚的组织板。神经元簇遍布心房，但与心脏基部相比，左心房的神经元更为丰富。
图5 位于较低位置的ICN的分布
像大脑中的神经元一样，这些神经元簇在动物之间的精确空间分布中可能会有所变化, 但可以识别，因为它们始终存在于相对于显著的心脏特征的粗颗粒解剖位置。通过分析这些簇中单个神经元的连通性和分子表型，可以确定ICN中的功能群。他们可能有一个一致的功能特异性投射的连接体，也可能有不同的分子表型。可通过图1B所示的数据采集流程获得ICN分析表型数据。图6和图7显示在此流程下获得的大鼠心脏切片。图6展示了包含ICN神经元的区域的概览，从这些区域获得激光捕获微解剖(LCM)样本，图7是单个神经元样本的详细神经元分组。
图6 雌性大鼠心脏B的候选切片
图7 增大的LCM切片提高了雌性大鼠心脏B的6个不同水平的心内神经元
3. 将ICN的三维解剖图与单个神经元的激光捕获显微解剖相结合进行分子表型分析
图6和图7中的剖面图来自一只雌性大鼠心脏，作者在其中绘制了ICN的三维组织。心脏在横切面上从基部和心尖之间向左端向前切开。所示的组织切片是在心脏ICN神经元存在的水平上有规律间隔的。在每一层中，被捕获神经元的位置用黄色表示。这些二维分布就像图2、图3、图4和图5所示的三维或堆栈，神经元分布相对连续，倾向于成群聚集。不同的簇广泛分开的细胞群与心房有关。切片从基底开始编号，在39至470切片中发现神经元。
图7中黄点标记的神经元表示ICN内的单细胞。通过在Z1水平执行LCM从组织提取的神经元标记为绿色（图7B和7C），从Z2水平提取的神经元标记为蓝色（图7D）。这样的微解剖神经元(n = 151)被用于进行单细胞转录组。每个神经元的分子表型与每个细胞在心脏三维坐标框架中的位置有关。
4. 三维ICN背景下单神经元的分子分析
从151个单神经元样本中获得了包含23,254个数据点的高通量转录组数据集（图8）。测定每个样品的154个基因的表达，所述154个基因的选择与神经调节和心脏功能有关。 作者进行了主成分分析（PCA）分析（图9）。作者将PCA结果产生的三个主要神经元组映射到它们在ICN三维坐标中的空间位置。 有趣的是，上下位置（从基部到顶点的方向）是沿着前两个主成分PC1和PC2的最健壮的聚类，前两个主要成分是基因表达数据中最主要的两个差异来源（图9A）。样本根据位置分为三组（Z1，Z2，Z3），其中Z1最靠近底部，向下移动到心房下部附近的Z3。检查Z组内样品的基因表达谱，在Z1，Z2和Z3位置组中的每个组中分别明显富集了不同的基因集，其中一小部分在Z2和Z3中均富集了（图9C）。值得注意的是，每个Z组中的神经元都是从多个神经节中分离出来的，这表明分子表型的异质性比这些神经元的空间分布更受限制。
图8 从大鼠心脏收集和定位神经元流程
图9 大鼠ICN中基因表达谱的空间梯度
作者还以成对的方式分析了选择的分子谱的分布，以评估ICN中常规描述的细胞类型的比较。 例如，成对比较Th和Npy的表达表明，虽然可以将几个神经元分类为Th或Npy，但是一部分神经元同时具有Th和Npy阳性。 这些Th + Npy +神经元分布在整个ICN中。这些结果与免疫组织化学的结果一致，在该组织中，观察到NPY阳性细胞和TH阳性细胞广泛分布在ICN中，但与其他结果中的表达却不相关。然而，对甘丙肽和Th的检查显示出更有条理的模式，在Z1位置组中甘丙肽的表达较高，但与Th的相关性很小。有趣的是，作者发现某些基因显示出非常强的空间定位偏差，并且以成对方式检查它们揭示了进一步的共定位模式。相比之下，具有高Npff表达水平的Z3位置组中的神经元表现出明显低的Dbh表达水平，而Z1和Z2神经元中的两个基因之间几乎没有相关性。使用前面几节中讨论的定位技术，作者还可以在这些基因的三维定位范围内可视化这些基因的表达模式，这使我们有可能更深入地研究它们的表达模式之间的关系。
使用具有85个自由度的单向方差分析评估了三个Z位置组之间基因差异的基因表达数据。 使用方差分析p <0.001的基因对样品进行分层聚类，阐明了神经元的四种亚型，其中亚型A和C主要在Z1组中发现，B在Z2组中发现，在D3在Z3组中发现，以及来自Z1组的许多样本（图10）。我们分析了空间组织的神经元亚型的分子模式，以确定相关的基因表达模块和区分每种神经元亚型的模块组合。例如，作者发现将Npff与Cxcr4表达进行比较会大大降低不同的表型。 作者发现，Npff和Cxcr4与Z分组的空间位置高度相关，其中Z1组显示了Npff的表达范围。但是，研究表型时，作者发现表型A主要由同时表达Npff和Cxcr4的细胞低表达组成，而表型C很大程度上解释了在Npff和Cxcr4中表达高的细胞。作者还研究了跨越四个确定的表型的神经肽和相应受体基因表达的分布。例如，甘丙肽及其受体Galr1之间的表达模式表明，表型A中的大多数细胞表达高水平的甘丙肽，其中很大一部分也表达高水平的Galr1，这表明表型A中的细胞在很大程度上通过两种途径驱动甘丙肽信号传导。与促甘丙肽相比，检查促甲状腺激素释放激素（Trh）及其受体Trhr之间的表达方式显示出非常不同的细胞间信号连接性。 尽管来自所有四个表型组的一小部分细胞显示Trh和Trhr的共表达，但最显着的模式是B型表型始终具有高水平的Trh，而不是Trhr，这表明B型表型的细胞主要充当Trh的来源。
图10 神经元表型有助于空间分离
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